人病原体难辨梭状杆菌中钴铁硫蛋白的克隆表达纯化fdurop

复旦大学2011届望道学者结题报告与心得集人病原体难辨梭状杆菌中钴铁硫蛋白的克隆、表达、纯化、以及甲基转移活性研究化学系 张思学指导教师 谭相石 摘要：本实验探索了一套有效的克隆、表达、纯化和体外重组具有生物活性的难辨梭状杆菌（Clostridium Difficile）中钴铁硫蛋白的方案。钴铁硫蛋白的两个亚基CfsAcd和CfsBcd分别构建入MBPHT-mCherry2和pETDuet-1载体，在大肠杆菌菌株BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中表达。其中CfsAcd采用了MBP标签可溶性表达，CfsBcd采用了包涵体提取的方法。利用Ni-TNA柱纯化后的两个亚基再体外组装钴胺素和铁硫簇Fe4S4。经过对重组的钴铁硫蛋白进行的ICP-AES金属含量分析、紫外可见光谱表征、和stopped flow快速反应动力学测定，证明了所重组得的蛋白结构正确，具有甲基转移的生物活性。关键词：难辨梭状芽孢杆菌；Wood-Ljungdahl代谢通路；钴铁硫蛋白；Fe4S4立方簇；钴胺素；大肠杆菌异源表达；甲基转移活性AbstractThe corrinoid iron-sulfur protein consists of two subunits, a cobalamin cofactor, and a Fe4S4 cluster. The genes encoding subunit and were recombined with vector MBPHT-mCherry2 and pETDuet-1 respectively . They are expressed in E. coli. strain BL21-CodonPlus(DE3)-RIL. Subunit was obtained by soluble expression with an maltose-binding protein(MBP) fusion tag. Subunit was extracted from inclusion bodies. Proteins were purified by Ni-TNA column and gel filtration column. After reconstitution of Fe4S4 and cobalamin, the corrinoid iron-sulfur protein can be obtained. The characterizations include ICP-AES, UV-vis, and stopped flow kinetics. It can be proved that the reconstituted corrinoid iron-sulfur protein has correct structure and methyltransfer activity. KeywordsClostridium Difficile; Wood-Ljungdahl pathway; Corrinoid iron-sulfur protein; Fe4S4 cluster; Cobalamin; E. coli expression system; Methyltransfer activity前言难辨梭状杆菌(Clostridium difficile)是公认的医院内感染和抗生素相关性腹泻最重要的病因。进入21世纪以来, 艰难梭菌感染(Clostridium difficile infection, CDI)的发病率和疾病的严重程度在全球范围内呈上升趋势。 2001年后, 在北美、澳大利亚及欧洲等国家, 出现了C.difficile 的高毒力菌株BI/NAP1/027/毒素型。C.difficile 相关性腹泻(Clostridium difficile -associated diarrhea, CDAD)的地区播散性暴发流行1,2, 常导致住院患者的病死率大幅升高。 CDI已成为一个严重的公共卫生问题3-5. 难辨梭状杆菌又称艰难梭菌, 是一种革兰阳性厌氧芽孢杆菌, 可存活于水、土壤等自然环境、动物体内及医院环境中, 其芽孢在医院环境及医务人员手上可存活6个月3。1935年, Hall和OToole首次从健康的新生儿粪便中分离出该菌,目前发现1%-3%的健康成人、40%-60%的新生儿、16%-35%的住院患者粪便中携带此菌6。C.difficile 通常产生两种主要毒素: 毒素A是一种肠毒素, 对白细胞有趋化作用, 主要引起肠道炎症、液体分泌和黏膜损伤, 也有一定的细胞毒性作用。毒素B是一种细胞毒素, 可刺激单核细胞释放炎性细胞因子, 对哺乳动物细胞产生细胞毒性作用。毒素B的毒力较毒素A强10倍7. C.difficile 是一种条件致病菌, 在正常人体内的细菌群中所占比例很少, 肠道的正常菌群能拮抗和制约C.difficile在肠道定居, 故一般不会致病。1978年, Bartlett等8首次报道了C.difficile释放细胞毒素是滥用抗生素引起伪膜性肠炎的病因, 这是由于抗生素的应用破坏了人体肠道的正常微生态平衡, 使C.difficile得以迅速繁殖并产生毒素而致病。由于CDI的严重危害性，有必要对艰难梭菌的代谢通路及潜在的药物靶点蛋白进行研究，以便设计出一些有效的抗生素类药物。本文所研究的钴铁硫蛋白(corrinoid iron sulfur protein，简称为CoFeSP )位于病原体难辨梭状杆菌Wood-Ljungdahl通路中。Wood-Ljungdahl代谢通路广泛存在于厌氧细菌和古细菌中，是厌氧微生物三条枢纽性碳代谢途径之一（逆三羧酸循环，3-羟基丙酸循环，Wood-Ljungdahl 通路9）。该通路可利用环境中的CO2合成重要的代谢中间体乙酰辅酶A10,11（过程见图1）。首先，二氧化碳在氢质子的参与下由甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase，简称为FDH) 催化还原为甲酸。随后，甲酸在另外四种酶的逐一催化下转变得到甲基四氢叶酸，甲基四氢叶酸在甲基转移酶 (methyltransferas，简称为MeTr) 的催化下将其甲基转移给钴铁硫蛋白，形成甲基钴铁硫蛋白，该蛋白再将其甲基转移给乙酰辅酶 A 合成酶(acetyl-CoA synthase，简称为ACS)形成甲基乙酰辅酶 A 。同时CO 脱氢酶 (Carbon monoxide dehydrogenase，简称为CODH)还原一分子的CO2产生 CO。在乙酰辅酶 A 合成酶的催化下由 CH3-ACS 的甲基与 CO 和辅酶 A合成乙酰辅酶 A，从而完成整个合成通路12。图1 Wood-Ljungdahl 代谢通路示意图钴铁硫蛋白是 Wood-Ljungdahl 通路中承上启下的甲基转移转化器, 它首先在甲基转移酶催化下接受甲基四氢叶酸的甲基(反应式1), 然后将甲基再转移给乙酰辅酶A 合成酶(反应式2):目前, 已经被分离和表征的 CoFeSP 有三种,它们分别来源于三种不同的厌氧细菌：产乙酸菌Moorella thermoacetica13, 产甲烷菌 Methanosarcina thermohila14 及产氢菌 Carboxydothermus hydrogenoformans15。 这些钴铁硫蛋白 CoFeSP 均为异源二聚体蛋白, 基因序列分析表明它们之间的基因同源性为35%53%。2006 年, Dobbek 等16在美国科学院院报(PNAS)上首次报道了来源于产氢菌 Carboxydothermus hydrogenoformans的 CoFeSP的晶体结构, 这是到目前为止唯一一个 CoFeSP 的晶体结构报道(见图2a)。 据目前已知的信息，CoFeSP是一个异源二聚体蛋白,包括一个大亚基(简称CfsA)和一个小亚基(简称CfsB)。两个亚基紧密的结合在一起, 呈假双重对称(pseudo- twofoldsymmetry)。金属中心包括一个类咕啉辅因子和Fe4S4 铁硫簇。其中类咕啉辅因子是一个具有维生素B12结构的咕啉环(见图2b)17, 中心钴原子除了与环上四个 N 原子配位以外, 还有两个开放的配位位点。铁硫簇呈立方结构，四个硫原子来源于CfsA上的四个半胱氨酸残基。CfsA包含三个结构域, Fe4S4 铁硫簇结合在 N 端结构域上, 中间结构域呈 ()8 筒状构象, 它和C-端结构域通过一个富含脯氨酸的连接片段(产氢菌中为18个氨基酸残基)来连接(图2c), 该连接片段在催化过程中起了非常重要的作用。CfsB只有一个结构域, 呈 ()8 筒状构象。图2 钴铁硫蛋白的结构a:产氢菌中CoFeSP的晶体结构（PDB ID 2H9A）：大亚基分子量为48.4 kDa (红色部分)，小亚基为33.9 kDa(绿色部分)。b: 钴胺素的分子结构 c: 产氢菌中CoFeSP大亚基晶体结构: 大亚基分为N端结构域(氨基酸残基158，绿色部分)、中间结构域(氨基酸残基59316，红色部分)、和C-端结构域(氨基酸残基334441，青色部分)。CfsB中的铁硫簇与CfsA的第一个氨基酸Pro59相距17. 以最近的铁钴之间的距离计算, 铁硫簇与类咕啉辅因子相距约有52之多。Dobbek 教授等提出了一个描述整个催化过程的模型。他们认为CfsA亚基C端结构域在催化过程中可以移动, 移动通过柔性的连接片段(氨基酸残基317333)来控制。该结构域的移动使得CoFeSP、ACS的活性位点和承载MeTr的甲基四氢叶酸能够进行必要的相互作用, 从而实现乙酰辅酶A 的合成, 而且C端结构域的构象变化可以有效的保护钴的两个开放配位位点（见图3）16.图3 钴铁硫蛋白的甲基转移催化机理模型橙色部分为乙酰辅酶A合成酶（ACS），蓝色部分为CfsBcd，红色部分为CfsAcd，绿色部分为甲基转移酶（MeTr）。虽然对产氢菌中的钴铁硫蛋白已经有了基因克隆和蛋白表达纯化的报道，也有了一定的结构和活性研究。但目前却没有任何关于病原体C.difficle 中的CoFeSP的基因克隆及蛋白表达与纯化的文献报道。基因组测序成功后，根据生物信息学，人们发现该基因组中两个编号为cd0725和cd0726基因片段分别含314和455个氨基酸残基，并将其命名为CoFeSP的亚基和亚基。为了以示区别，将C.difficile中的亚基简称为CfsAcd，亚基简称为CfsBcd。由于产氢菌中该蛋白的晶体结构已有报道，并且也有相关的生物活性实验数据，这就为本病原体中该蛋白的研究提供了参考的依据以及可供比较的数据。目前仅有的两篇关于嗜热菌中CoFeSP 的大肠杆菌重组表达的报道，均是在得到前体蛋白以后进行化学重组从而得到全蛋白18,19。主要有两个原因，首先该类蛋白的铁硫簇处在蛋白的表面，由于铁硫簇厌氧的特性，因此极易被破坏，需要通过化学重组来重新组装；其次，大肠杆菌重组表达含钴啉和类钴啉的金属蛋白，要想通过生物组装来实现，条件要求很苛刻。所以化学重组仍然是一种比较通用的方法。1实验部分1.1实验材料和仪器病原体C.difficile 630 基因组DNA购自美国ATCC （编号9689D-5）。MBPHT-mCherry2 载体为复旦大学生命科学学院丁滪博士馈赠。pETDuet-1、TEV 酶表达质粒pRK1043、大肠杆菌菌株XL10-Gold和BL21-CodonPlus(DE3)-RIL 购自Novagen 公司。Pfu DNA聚合酶、T4 DNA 连接酶，dNTP 以及限制性内切酶（BamHI、XhoI）购自英国纽英伦生物技术有限公司。PCR引物片段的合成以及PCR产物的测序工作由英潍捷基（上海）生物科技有限公司完成。质粒纯化试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、氨三乙酸镍免疫体异性结合树脂（Ni-NTA）、葡聚糖凝胶树脂G25购自凯杰生物工程有限公司（加利福尼亚）。凝胶层析柱Superdex TM 75 HiLoadTM 16/60、凝胶层析柱Superdex 200购自法玛西亚公司。Chelex 100离子螯合树脂购自伯乐生物医学产品有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自索莱宝（北京）科技有限公司。所有蛋白质的纯化操作均在手套箱中进行。操作条件为温度2025，N2:H2 =19:1的气氛。手套箱为Braun公司的MB100型。1.2 CfsAcd和CfsBcd的基因克隆及重组质粒的构建编码CfsAcd和CfsBcd的基因片段均克隆自难辨梭状芽孢杆菌（clostridium difficile 630）。编码两个亚基的基因分别编号为CD0725 和CD0726，经序列同源性分析，推定确为编码钴铁硫蛋白中和CfsBcd的基因。克隆CfsAcd的PCR过程所用上游引物为5-CGCGGATCCGGCGGCGGCAGCGGTATGGCATTAAAAGCTTTAG-3，包含有BamHI的限制性内切酶位点，以及四个甘氨酸残基和一个丝氨酸残基组成的linker(GGGSG)。下游引物为5-CCGCTCGAGTTATTAGTTTGTTTGGCATG-3，包含有XhoI的限制性内切酶位点。PCR反应程序如下：预变性: 95 ，5 min ；变性：95 ；退火：55 ，1 min；延伸：72，2min；最后延伸：72，10 min。其中变性退火延伸循环 30 次。所得PCR产物经过酶切消化、连接入MBPHT-mCherry2 载体，再转入高拷贝菌株E. coli XL10-Gold中扩增，并抽提出足量重组质粒，-20冷冻保存，以备后续实验使用。该重组质粒命名为MBP-。克隆CfsBcd的PCR过程所用上游引物为5-CGGGATCCATGGCATTTAAAATGTCTACTC-3，包含有BamHI的限制性内切酶位点。下游引物为5- CCCAAGCTTTTATTAAGCTAATGCGTTAACCAATT-3，包含有XhoI的限制性内切酶位点。PCR反应程序如下：预变性: 95 ，5 min ；变性：95 ；退火：55 ，1 min；延伸：72，1.5min；最后延伸：72，10 min。其中变性退火延伸循环 30 次。所得PCR产物经过酶切消化、连接入pETDuet-1载体，再转入高拷贝菌株E. coli XL10-Gold中扩增，并抽提出足量重组质粒，-20冷冻保存，以备后续实验使用。该重组质粒命名为Duet-。CfsAcd和CfsBcd的重组质粒经测序验证，序列正确。1.3 CfsAcd和CfsBcd的表达与纯化CfsAcd采取了MBP融合标签可溶性表达方案。CfsBcd由于无法很好的可溶性表达，因此采取了包涵体提取的方案。CfsAcd使用蛋白表达菌株E. coli BL21 (DE3) Codon Plus RIL （T7噬菌体RNA 聚合酶依赖的转录体系）。将新转化好的大肠杆菌用含氨苄青霉素的固体培养基进行筛选。挑斑到50ml氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中（蛋白胨 10g/L， 5g/L 酵母提取物， 10g/L NaCl，50g/mL 氨苄青霉素)，37，250rpm培养3h。再将该菌液接入8L含有氨苄青霉素的2YT液体培养基中(蛋白胨 16g/L， 10g/L 酵母提取物， 16 mM KH2PO4， 73mM K2HPO4， pH=7.6，50g/mL 氨苄青霉素)。使用发酵罐以37有氧培养到OD600约为0.6时，加入0.2 mM异丙基-g-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）作为诱导剂启动蛋白表达。同时通入氮气，降温至20，120rpm，并加入5g/L的葡萄糖，厌氧发酵过夜。培养液以5,000g 、4.冷冻离心12min，收集菌体组分。菌体组分液氮冷冻后贮藏于-80冰箱，以备后续实验使用。菌体湿重平均3040g/8L。目的蛋白的分离纯化操作均在手套箱中进行，操作温度2025。纯化过程所使用的Buffer A组分为50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（TrisHCl），100mM 氯化钠，5 mM -巯基乙醇，pH=7.6。Buffer B为50mM TrisHCl，pH=7.6。首先取30g菌体重悬于100mL 裂解缓冲液中（100mL Tris Buffer，1mM苯甲基磺酰氟，25U脱氧核糖核酸酶I，40U 溶菌酶）。冰浴搅拌20min后进行超声破碎。将破菌液以12000g、4冷冻离心20min。取上清液用45M过滤膜过滤，上到用Tris Buffer平衡的Ni-NTA柱上，先用含5mM 咪唑的Tris Buffer冲洗至用考马斯亮蓝检测流出液中几乎无蛋白，再用含20mM咪唑的Tris Buffer冲洗3倍柱体积，最后用含100mM咪唑的Tris Buffer洗脱目的蛋白。蛋白洗脱液用Buffer B透析除去咪唑后加入6His tag-TEV蛋白酶进行酶切（蛋白与蛋白酶摩尔浓度比50:1，酶切时间为12h）。然后通过反相挂柱，用Ni-NTA除去蛋白酶和MBP标签，得到不含标签的CfsAcd。该产物可通过SuperdexTM G-200凝胶层析柱进行进一步纯化。CfsBcd采取与CfsAcd相同的表达方案。得到的菌体取30g重悬于100mL裂解缓冲液中。冰浴搅拌20min后进行超声破碎。将破菌液以12000g、4冷冻离心20min。取沉淀组分， 用Tris Buffer漂洗两次。然后将沉淀组分用100mL变性缓冲液（100mL Tris Buffer，6M盐酸胍）变性重溶，冰浴搅拌1h。如仍有不溶组分，可离心除去。变性蛋白液上到用变性缓冲液平衡的Ni-NTA柱上，先用含5mM 咪唑的变性缓冲液冲洗至用考马斯亮蓝检测流出液中几乎无蛋白，再用含20mM咪唑的变性缓冲液冲洗3倍柱体积，最后用含100mM咪唑的变性缓冲液洗脱目的蛋白。蛋白洗脱液在冰浴搅拌的条件下缓慢加入20倍体积的Tris Buffer稀释，再经过超滤后，用Buffer B透析除去盐酸胍和咪唑，得到复性的CfsBcd。该产物可通过SuperdexTM G-75凝胶层析柱进行进一步纯化。蛋白纯度使用SDS-PAGE进行检测（见图4），蛋白浓度使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行检测。每g菌体可以纯化出CfsAcd约2mg，CfsBcd约10mg。图4 SDS-PAGE结果a: CfsBcd诱导前后对照结果，1为Marker(分子量单位kDa)，2为诱导后菌液(含CfsBcd, 35 kDa），3为诱导前菌液；b: CfsBcd纯化结果，1为Marker，2为纯化后的CfsBcd 蛋白(35 kDa)；c: CfsAcd诱导前后对照结果，3为Marker，2为 诱导后的菌液（含MBP-CfsAcd，96 kDa)，3为诱导前的菌液；d: CfsAcd的纯化结果，2为Marker，1 CfsAcd蛋白（53 kDa）1.4钴铁硫蛋白的重组重组的操作均在手套箱中进行。取apo-CfsAcd，超滤至浓度为100M，加入终浓度10mM DTT（1M储备液），冰浴搅拌下缓慢加入10倍摩尔量的Fe(NH4)2(SO4)2（120mM储备液）。然后再加入10倍摩尔量的Na2S（120mM储备液），冰浴搅拌1h。用G-25凝胶层析柱除去过量的小分子，得到重组好铁硫立方簇的Fe4S4-。在避光条件下取前体蛋白apo-CfsBcd，超滤至浓度为100M，加入终浓度10mM DTT。冰浴搅拌下缓慢加入10倍摩尔量的钴胺素（120mM储备液），保持冰浴搅拌1h。用G-25凝胶层析柱除去过量的小分子，得到重组好钴胺素的CoB-CfsBcd。将等摩尔量的Fe4S4-CfsAcd和CoB-CfsBcd混合在一起，冰浴搅拌10min得到重组的钴铁硫蛋白。1.5金属含量分析金属含量分析通过电感耦合等离子发射光谱仪 (ICP-AES) 进行测定。蛋白样品的准备如下：取一定量的待测蛋白溶液，加入到Chelex100离子螯合树脂处理过的二次蒸馏水中，再加入65L优级纯的浓硝酸，定容为10mL，使蛋白终浓度为150nM，硝酸终浓度为0.2M。空白溶液的准备如下：取等体积的待测蛋白的Buffer溶液（不含蛋白），65L优级纯的浓硝酸，定容为10mL。两个溶液均60消化12h后上机测定。测定仪器型号为ICP 光谱分析仪 (IRIS Intrepid) 。测定样品为重组CoFeSP。1.6紫外可见光谱测定仪器：HP8453 紫外可见光谱仪 (Agilent, USA)。将重组CfsAcd、CfsBcd和重组CoFeSP蛋白样品分别置于比色皿中，密闭后载出手套箱，测定其UV吸收光谱；还原态的CfsAcd和重组CoFeSP蛋白样品加入新鲜制备的连二亚硫酸钠(终浓度2mM)混合后密闭于比色皿中，载出手套箱后测定混合2min时的UV吸收光谱。1.7 Stopped-flow法测定甲基转移反应蛋白的甲基转移酶活性测定实验在SF-61 DX2型Stopped-flow 光谱仪（Hi-Tech, UK, Dead time is 1 ms）与计算机联用设备上测定。样品混合及数据处理通过计算机完成，温度通过与进样系统相连的超级循环恒温水浴装置控制。反应前的两个混合溶液为：溶液A，其中包含200 M 甲基四氢叶酸, MeTrcd 浓度为1 M, 1mM 柠檬酸钛 (III) , 0.1 M MES, 0.1 M 氯化钠；溶液B，包含 20 M CoFeSPcd, 1mM柠檬酸钛, 0.1 MES, pH 5.1, 0.1 M 氯化钠。通过计算机程序控制将两溶液等体积快速混合进行反应。监测390 和450nm 处的吸收随时间变化的曲线，曲线用计算机软件用一级反应方程进行拟合。1.8序列相似性分析在NCBI GenBank 中通过BLAST搜索得到C.difficle中CoFeSP的CfsAcd及其类似序列。两个序列之间用BLAST2进行比对 (网址：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi) 分析得到C.difficle中CfsAcd与其它序列的相似性。所有的CfsAcd蛋白质序列用CLUSTAL X进行比对。CfsBcd也是用相同的方法进行比对。2结果与讨论2.1 DNA序列比对分析通过序列比对可以发现，CfsAcd和CfsBcd与目前作为模型研究的产氢菌Carboxydothermus hydrogenoformans 中钴铁硫蛋白的CfsA和CfsB同源性为38%（序列比对结构见图5）。病原体中的CfsAcd和CfsBcd的长度分别为455和314个氨基酸残基，与产氢菌中的CfsA和CfsB的长度446和323个氨基酸残基基本相等，且活性位点的关键残基高度保守。其中对CfsAcd的序列比对显示， 病原体CfsAcd1742位的氨基酸残基具有 Fe4S4 的典型结合单元CysX2CysX4CysX16Cys。此外CfsAcd第373378位这段序列与产氢菌大亚基第370375位的差异也值得注意。该段氨基酸残基是与钴胺素底位接触的一段保守区域。但是C.difficle中CfsAcd的374位为色氨酸，而对应于产氢菌大亚基的第371位则为亮氨酸。由于色氨酸的羟基可能与钴胺素上的钴离子配位，故C.difficle中CfsAcd与钴胺素的相互作用跟产氢菌大亚基相比还是存在差异的。综合上述结果，可以初步的判定，本病原体中的钴铁硫蛋白应与该产氢菌中的钴铁硫蛋白在结构上是相似的，生物催化功能上是一致的，但催化活性应有差异。图5 CfsBcd和CfsAcd的序列比对Gamma_Cd表示C. difficile中的CfsAcd，Gamma_Mt代表产氢菌中的CfsA; Delta_cd代表C. difficile中CfsBcd，Delta_Mt代表产氢菌中的CfsB。2.2 CfsAcd和CfsBcd的表征2.2.1 ICP-AES表征对重组后的钴铁硫蛋白进行的ICP-AES金属含量分析表明，每个钴铁硫蛋白中平均含有1个钴胺素和2.03个铁离子。与理论值1：1和1:4相比，钴胺素的组装效率近似为100%，铁硫立方的组装效率为50%。2.2.2 UV-Vis表征重组后Gamma 亚基的紫外可见光谱显示在 410nm 附近区域存在一个典型的吸收峰（见图6），并且在加入还原剂连二亚硫酸钠以后，该吸收峰明显降低。这是蛋白具有典型的 Fe4S4 的有力证据。该结果表明gamma亚基的重组实验成功组装了其金属中心 Fe4S4。Delta 亚基的紫外可见光谱显示在 390 nm 和 550 nm 处存在两个典型的吸收峰（见图10）。这分别代表了氧化态类钴啉 (I) 和还原态类钴啉 (III) 的吸收峰。重组所用的钴胺素中钴离子为Co(III)，重组过程中由于加入了还原剂DTT，使部分钴离子被还原了为了Co(I)，因此紫外可见光谱呈现混合价态。该结构表明delta亚基的重组实验成功组装得了其金属活性中心类钴啉。将上述重组好的gamma 和delta两个亚基以摩尔浓度比1比1进行混合即可得到具有完整金属中心铁硫簇和类钴啉的钴铁硫蛋白，随后测定其紫外可见吸收光谱。紫外光谱数据如图7所示。重组CoFeSPCd 在410 nm附近的特征吸收峰表明重组以后 Fe4S4 仍然存在。用连二亚硫酸钠还原CoFeSPCd后，该吸收峰消失更进一步验证了这一点(见图8)。但是与文献中报道过的CoFeSPMt的紫外可见光谱相比，470 nm 处二价钴的特征吸收峰并不明显。由于重组后CoFeSPCd的紫外可见光谱基线比较高，可能对代表二价钴的470 nm处肩峰有一定的遮盖作用。也有可能是还原剂DTT的加入使钴离子容易呈现一价的还原态，而不停留在二价。但二价钴特征吸收峰消失的真正原因还有待于进一步的研究。总体来说，CfsAcd和CfsBcd的紫外可见光谱所表现的特性与Ferry等人研究的嗜热菌中钴铁硫蛋白的两个亚基的紫外可见光谱性质是相符的18。图6 重组CfsAcd的紫外可见吸收光谱20 M蛋白, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 充入氮气保护。 曲线A 为还原前的重组CfsAcd，曲线B为加入2 mM 连二亚硫酸钠于25C还原10 min.图7重组 CfsBcd的紫外可见吸收光谱20M蛋白，50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 充入氮气保护图8 重组钴铁硫蛋白的紫外可见光谱20M蛋白， 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, CoFeSPcd加入 2 mM连二亚硫酸钠于25C还原10 min 2.2.3 Stopped flow快速反应动力学表征为了检验重组出的CoFeSPcd是否具有甲级转移的生物催化活性，使用截流光谱仪对其接受甲基的能力进行了表征。实验过程中同时监测450nm和390 nm波长。实验结果如图9所示。其中450nm为Co(III)-CH3的特征吸收峰，390nm为未结合甲基的Co(I)的特征吸收峰。在有还原剂接受甲基化所释放的电子时（本实验中为Ti(III)，生物体内为NADPH），CoFeSPcd可以逐渐将甲基转移酶中四氢叶酸上的甲基结合到钴离子上（实验中所用的甲基转移酶根据已经报道的方法制备20）。整个过程中，390nm吸收峰会下降，450nm的吸收峰会升高。实验结果与理论预测相一致。所得曲线用一级方程拟合可得速率常数，对应450 nm的曲线，拟合速率常数为 27 mM-1s-1，对应390nm的曲线，拟合速率常数为 25 mM-1s-1图9 钴铁硫蛋白的甲基转移反应25，在0.1M MES缓冲溶液中（pH 5.1 , 离子强度0.1）将甲基四氢叶酸 (终浓度: 60 M) 与CoFeSPcd (终浓度: 10 mM,) 混合，用1 M 来自C.difficile的甲基转移酶催化反应. 用390nm和450nm波长监测反应速率3总结本文首次对病原体 C. difficile 630 中编号为 CD0725 和CD0726、推定为属于编码钴铁硫蛋白gamma 和delta亚基的基因进行了克隆、表达与纯化，成功建立了一套较为高效的重组表达体系。经ICP-AES、UV-Vis与Stopped flow的表征，证明了通过化学重组的方法可以成功得到具有完整金属中心铁硫簇和类钴啉的钴铁硫蛋白。这一研究为后续的结构与功能的研究奠定了坚实的基础。钴铁硫蛋白也有望成为一种针对C. difficile的药物设计的靶点蛋白，从而帮助人们开发出更好的抗生素类药物，减小CDI和CDAD所带来的危害。参考文献1 Ppin J, Valiquette L, Alary ME, Villemure P, Pelletier A, Forget K, Ppin K, Chouinard D. 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