PPARβδ激活对大鼠心肌成纤维细胞胶原表达和细胞增殖的影响(可编辑)

PPAR激活对大鼠心肌成纤维细胞胶原表达和细胞增殖的影响 中山大学博士学位论文PPAR/激活对大鼠心肌成纤维细胞胶原表达和细胞增殖的影响姓名:张会杰申请学位级别:博士专业:药理学指导教师:刘培庆20070528/激活对大鼠心肌成纤维细胞胶原表达和细胞增殖的影响专业: 药理学博士生: 张会杰导师: 刘培庆教授中文摘要高血压病是一种常见病、多发病,极易导致心、脑、肾等靶器官损害,严重威胁人类的健康。其中,由心脏成纤维细胞 。增殖和胶原表达过多所导致的心肌纤维化是高血压心室肥厚由代偿向失代偿转化的重要病理过程,是引发心力衰竭的核心环节。目前心肌纤维化的确切发病机制并不十分明确,但近年来心肌纤维化的治疗已成为国内外研究的热点。其中,过氧化物酶体增殖剂激活型受体 ? ,与心肌纤维化的关系越来越受到人们的关注。和鼬激活可以抑制心肌纤维化,但与它们结构和功能相类似的/对心肌纤维化的作用却未见报道。本研究旨在细胞水平模拟心肌纤维化,探索/激活对血管紧张素,诱导的成年大鼠胶原表达和细胞增殖的影响及其可能的机制,为心肌纤维化的治疗提供新的作用靶点,以有利于抗心肌纤维化药物的研发。第章成年大鼠心肌成纤维细胞/的表达情况目的:/体内分布广泛,其中心脏/表达水平较高。心脏主要由心肌细胞和组成。心肌细胞表达邸,但是否表达邛/至今尚未皇些盔堂蔓主堂垡堡塞 坠垦堕燮煎墅盔基:坚墼盛堑丝塑堕堕堕耋垄塑垫墼塑堕丛墅堕见报道。本研究体外成功地培养了成年大鼠,并在此基础之上探讨成年大鼠是否表达/。方法:.采用胶原酶一胰酶一胶原酶消化和差速贴壁法分离成年大鼠。倒置显微镜和免疫细胞化学染色鉴定细胞,同时绘制细胞生长曲线了解生长特性。.以乳鼠心肌细胞作为阳性对照,采用和 研究成年大鼠是否表达/。.从水平研究中 个亚型的表达情况。结果:.采用胶原酶胰酶一胶原酶法分离细胞,细胞收率高,而且培养成本较低。倒置显微镜,原代培养的呈梭形或不规则三角形,胞质淡折光性强,细胞核较大,呈椭圆形,无自发性搏动。培养的细胞波形蛋白染色阳性,因染色阴性,.染色阴性,符合染色特征,细胞纯度大于%。第.代的生长曲线无明显差异,适于开展细胞实验。.成年大鼠在和蛋白两个水平都检测到邓/表达,而且的/表达量较心肌细胞低.。.同时表达个亚型,/和表达量较高,而表达量最低.。结论:我们建立的成年大鼠培养方法成本较低,细胞收率较高,细胞纯度高,第代细胞适于开展相关实验。成年大鼠表达/,而且在个亚型中表达量较高。表达邸/是开展后续实验的前提和基础。关键词:细胞培养;/;受体表达;第章对心肌成纤维细胞胶原表达和细胞增殖的影响目的:和激活可以抑制心肌纤维化,但与它们结构和功能相类似的诱导的成/对心肌纤维化的效应却未见报道。本研究成功地建立了年大鼠胶原表达和细胞增殖的模型,并在此基础之上探讨岬激动剂对细胞胶原表达和细胞增殖的影响。方法:.摸索四年大鼠胶原表达和细胞增殖的量效和时效关系,建诱导的胶原表达和细胞增殖模型。立.利用法探索成年大鼠使用的安全剂量范围。.采用、掺入和.掺入等方法,探讨对诱导的成年大鼠胶原表达、胶原合成和细胞增殖的影响。结果:.作用于,可以浓度依赖和时间依赖地促进表达型胶原。.作用于.,可以浓度依赖和时间依赖地增加对.的摄取量。.对的细胞数无影响俨. .对照组,而的明显地降低的细胞数尸. .对照组。.小预处理 ,可以浓度依赖性地抑制诱导的胶原表达和胶原合成,而本身对细胞的胶原表达和胶原合成的无影响。“浓度依赖性地抑制诱导的摄取,而不影响细胞对.的基础摄取量。结论:成功建立 诱导的胶原表达和细胞增殖的细胞模型。/激动剂可以抑制诱导的细胞胶原表达和细胞增殖,其中抑制细胞胶原表达的效应与其降低细胞胶原的合成有关。关键词:;胶原表达;细胞增殖;细胞培养第章/激活介导对心肌成纤维细胞的效应目的:可以抑制诱导的细胞胶原表达和细胞增殖。的效应除町能通过激活邮来实现外,也町能通过调节的表达量或通过不依赖于/的途径来实现。本研究观察了对 /表达量的影响,并利用干扰,来探索的作用是否依赖于阶。方法:.采用和 探讨是否影响 /的表达量。.以作为阴性对照,对针对/的、和转染。转染细胞后,和 检测各组细胞邸/的表达水平,筛选有效干扰序列。.有效于扰序列抑制细胞/表达后,采用 、.诱导的细胞胶原表达、胶原合成和?掺入等方法研究对和细胞增殖的效应有无变化。结果:.、和组细胞/的表达量与对照组相比无差异.。不影响. .对照组。而对/的表达俨.对都显著地抑制细胞/的和蛋白表达俨.和蛋白表照组,其中的抑制作用最强,分别降低/达%和%。.抑制/表达后,逆转了对诱导的细胞胶原表达、胶原合成和细胞增殖的抑制作用俨.组。而 对的效应无影响妒.组。结论:不影响 /的受体表达量:能显著地抑制/的表达;对的效应具有/依赖性。因此,/激活介导了对的效应。关键词:酬。炉翼厩受冀斧。裴培养第章初步探讨/激活所产生效应的机制目的:本实验旨在研究/激活所产生效应的可能机制。以往的研究表明,诱导的胶原表达和细胞增殖可能与其刺激细胞生成活性氧,有关。而激动药通过调节细胞的生成,可以抑制细胞胶原表达和细胞增殖。邓/的效应也可能与其调节细胞的生成有关。方法:.荧光显微镜和流式细胞仪测定是否影响诱导的生成。.采用、掺入和.掺入等方法,探讨是否参与对胶原表达、胶原合成和细胞增殖的抑制作用。结果:的生成显著增加.,.与对照组相比,组组细胞的生成无明显变化尸.。而预处理后显著地抑.组。制诱导的生成.促进胶原表达、胶原合成和细胞增殖,而生成抑制剂.和可以同等程度地抑制诱导的细胞胶原表达、胶原合成和细胞增殖。结论:抑制诱导的胶原表达和细胞增殖的作用与其抑制细胞的生成有关。参与了/激活所产生的效应。关键词:;怕:;胶原表达;细胞增殖论文总结:本研究首次发现成年大鼠表达/,邓/激动剂可以抑制诱导的胶原表达和细胞增殖,的效应与其激活胂和抑制生成有关。我们的研究为/激动剂用于心肌纤维化的治疗提供了依据,将有利于抗心肌纤维化药物的研发。主坐盔堂堕主堂垡堕皇 坠垦箜堂适塾盔基:堂墼堕堑丝塑堕壁堡耋垄塑塑堕垄堕塑墅堕 /: :. , . .,. 勰., .,事/一 . .坠垦堕塑适型盔垦:坚盟盛堑丝塑堕堕堕室姿塑塑堕塑堕盟墅堕坐盔堂堡主堂堡迨塞/ . / ./ , ./.,. . . /. .,. %. . . ./ .?/. /./, .;/; ; ., / , / ,. . .,.? .?一. 尸. .,儿 . . 一 . ?. ?一“ . ? . .; ; ;/,. , . ,./. / .墨/ .,. . .,.缸. ./ ./仃 妒.,/晰俨.% %,邵/ .邓/. ,. / ./ .,/些盔堂竖主堂堡丝塞坠曼堕丝堡型盔垦:垒盟盛堑丝塑堕堕堕塞垄塑塑堕丝堕盟墅堕.;/; ; / ?. ,. /. . . . ?. , 俨. /? .,坠墨咝壅适墅盔基:垒墼堕堑丝塑堕堕堕耋垄塑塑堕丝堕盟芝旦生坐盔堂堕主堂垡迨窒., ,.烈/.;, 气岱/ / / .,口/ . 缩略词表前 言高血压病是一种常见病、多发病,极易导致心、脑、肾等靶器官损害,严重威胁人类的健康。其中高血压左室肥厚既是高血压病重要的并发症,又是心肌梗死、心力衰竭和猝死等心脏事件的独立危险因素。高血压左室肥厚主要包括两方面的改变:心肌细胞肥大、肌丝排列紊乱及收缩力下降;心脏成纤维细胞过度增殖和胶原表达增多,两者共同构成了左室肥厚的细胞病理学基础【”。增殖和胶原表达过多所导致的心肌纤维化是左室肥厚由代偿向失代偿转化的重要病理过程,是引发心力衰竭的核心环节。目前心肌纤维化的确切发病机制并不十分明确】,但近年来心肌纤维化的治疗已成为国内外研究的热点。其中,过氧化物酶体增殖剂激活型受体与心肌纤维化的关系越来越受到人们的关注。心肌纤维化心脏由心肌细胞和间质细胞组成。心肌细胞占心脏总体积的%,但细胞数仅占心脏细胞总数的/。出生后心肌细胞丧失增殖能力,是高度分化的终末细胞,主要起收缩功能【】。问质细胞由、微血管平滑肌细胞、神经细胞、巨噬细胞等组成,它们仅占心脏体积的%,但其细胞数占心脏细胞总数的/。约占心脏细胞总数的%,非心肌细胞的%,是合成心肌胶原的主要细胞,也是心肌纤维化的主要效应细胞【】。心肌纤维化主要的病理特征是过度增殖和胶原表达增多【。心肌纤维化使心肌硬度增加,顺应性下降,导致心脏舒张、收缩和传导功能都发生障碍,同时致动脉血管壁增生,管腔缩小,毛细血管密度降低,心肌血供减少,心肌功能受损【】。因此,心肌纤维化是心力衰竭、心律失常和猝死发生的关键环节。目前心肌纤维化的确切发病机制并不十分明确。以前的研究认为,心肌纤维化的形成过程中,心室负荷增加等血流动力学因素起着决定性作用。但近来研究发现,上述观点并不正确,具体原因如下:单纯心脏容量负荷增加和心肌组织牵张并不足以导致心肌纤维化。高血压心脏病患者心肌纤维化不仅出现主些盔堂堕主堂鱼堡塞 坠垦竺塑堑型盔基:垒墼盛堑笙塑堕堕堕壅垄塑塑堕塑堕笪墅堕在左心室,也出现在右心室,甚至室间隔。等【采用免疫组织化学方法研究发现,在不同的高血压模型中,血管周围纤维化不仅出现在肥厚的左心宦,而且也出现在未发生肥厚的右心室。降压药物逆转心肌纤维化的能力不依赖于其降压疗效【。心肌纤维化可能是刺激胶原合成的因子和抑制胶原合成的因子作用失衡所致,当刺激胶原合成的因子增多和/或抑制胶原合成的因减少,其总效应即表现为刺激胶原合成,促进心肌纤维化【】。促进胶原合成的因子有、转化生长因子.。、内皮素.和醛固酮掣,;抑制胶原合成的因子有前列腺素、氧化氮和缓激肽等?。心肌纤维化主要分为以下三种类型,】:反应性血管周围纤维化:心肌胶原首先在心脏冠状动咏周围聚集,这是心肌纤维化的早期阶段,也是程度最轻的心肌肌纤维化。间质纤维化:心肌胶原由冠状动脉周围扩展到生理状态无胶原存在的肌间隙。修复性或替代性纤维化:心肌细胞周围胶原沉积的增多和胶原类型的改变降低了心肌收缩的势能储备,使心脏的后负荷增高,这种收缩能力和后负荷的不平衡导致心肌细胞坏死。为了维持心脏结构和功能的完整性,坏死心肌细胞周围的增殖、合成新的胶原,替代已经坏死的心肌细胞,形成“疤痕”。目前心肌纤维化的研究主要采用两类模型:体内模型和体外模型【。体内模型包括醋酸脱氧皮质酮盐大鼠、腹主动脉缩窄大鼠,灌注大鼠等。体外模型有、缺氧复氧、醛固酮等诱导的胶原表达和细胞增殖。其中,诱导的胶原表达和细胞增殖是目前最常用的心肌纤维化体外模型,本研究亦采用该体外模型。二心肌纤维化的治疗目前心肌纤维化的治疗已经成为国内外研究的热点,可能用于心肌纤维化治疗的药物主要有如下几类:一抑制肾素一血管紧张素系统的药物肾素一血管紧张素系统通过产生作用于心肌上的受体,可以促进增殖、胶原蓄积和整体动物发生心肌纤维化抑制肾素一血管紧张素系统的药物可以用于治疗心肌纤维化,此类药物包括血管紧张素转化酶抑制药和受体阻断药。一系列动物实验表明,血管紧张素转化酶抑制药一群多普利【】、喹那普利、雷米普利刀和赖诺普利【朝能够减轻大鼠心肌胶原沉积、逆转心肌纤维化。动物实验的结果在临床研究中得到了进一步的验证。一项研究采用赖诺普利治疗左室肥厚伴左室舒张功能减退的高血压病人,药物治疗个月后,病人左室舒张功能显著改善,心肌纤维化明显减少【】。等【报道高血压心脏病患者采用培哚普利治疗个月后,动脉纤维化显著降低,冠脉血流显著增加。动物实验表明受体阻断药一氯沙坦能够促进自发性高血压大鼠心脏的胶原降解,抑制心肌纤维化【.在一项名高血压心脏病患者参与的临床试验中,氯沙坦治疗个月后,病人的心肌纤维化程度明显降低【。虽然动物实验和临床研究均证实血管紧张素转化酶抑制药和受体阻断药具有抗心肌纤维化作用,但目前临床研究样本数均较少皆小于例,因此尚需大规模的随机对照临床试验进一步验证。二醛固酮拮抗药近年来,人们发现醛固酮拮抗药可以减轻心肌纤维化。体外研究表明,醛固酮可以促进合成胶原,而安体舒通可以阻止醛固酮的效应捌。这一效应也在动物实验中得到了证实,安体舒通可以抑制醛固酮诱导的心肌纤维化嘲,安体舒通和依普利酮均能降低自发性高血压大鼠心肌纤维化的程度瞄,。但迄今为止,尚无临床证据表明醛固酮拮抗药能减轻高血压心脏病患者的心肌纤维化。三内皮素受体拮抗药表达和受体,通过作用于受体,可以促进增殖和细胞合成胶原、提高基质金属蛋白酶的活性【。受体拮抗药可以诱导的增殖和胶原代谢【。受体拮抗药也可以抑制抑制和盐大鼠的心肌纤维化嚣。但临床研究表明,受体拮抗药对于慢性心衰患者发生的急性心肌梗塞没有改善作用【。四他汀类药物他汀类药物是临床上常用的降血脂类药物,但近来研究发现其具有抗心肌纤维化的作用。他汀类药物町以降低压力超负荷动物和肥厚性心肌病动物的心肌纤维化“。他汀类药物也能够抑制.还原酶,减少其下游产物甲羟戊酸的合成,使蛋白不能在细胞膜上的定位和活化,从而抑制的增殖【】。但目前尚无临床试验证实他汀类药物口丁以抑制心肌纤维化。五抗细胞因子治疗目前,系统研究过的抗纤维化细胞因子有肿瘤坏死因子.,干扰素叫和.,其中有关的研究最多。?是重要的促纤维化生长因子,活化的.町以抑制的降解、促进的合成。掣采用.中和性抗体降低了压力超负荷大鼠的心肌纤维化。等九发现.中和性抗体可以拮抗.的致肝纤维化作用。六代谢抑制剂心肌纤维化过程中,细胞外基质,代谢紊乱起了非常重要的作用。作用于代谢关键酶如的药物可以治疗心肌纤维化。等【】研究发现,非选择性抑制剂一可以降低心梗小鼠的左心室扩张和纤维化。类似的研究中,非选择性抑制剂.町以减轻大鼠心肌纤维化,部分恢复心脏的功能【】。多西环素是唯一批准临床使用的抑制剂,但其适应症仅限于治疗牙周疾病【】。目前,尚无临床试验证实多西环素可以抑制心肌纤维化。七毗非尼酮吡非尼酮是一种解热镇痛药,不少研究表明吡非尼酮具有抗纤维化作用。吡非尼酮能够抑制盐大鼠的左室肥厚和心肌纤维化四,减轻阿霉素诱导的心脏氧应激损伤和后续的心肌纤维化刺。另外,吡非尼酮也能抑制博来霉素诱导的肺纤维化。吡非尼酮抗纤维化的机制并不十分清楚,可能与其降低.表达从而抑制成纤维细胞增殖和胶原合成有关【。吡非尼酮治疗特发性肺纤维化和肾小管间质性纤维化的期临床试验已经在进行【,但其对心肌纤维化的效果还有待于临床试验进行评价。八曲尼司特曲尼司特属邻氨基苯甲酸类抗炎药,临床上常用于皮肤疾病和过敏性疾病的治疗,近来发现曲尼司特具有抗心肌纤维化作用。等采用盐大鼠模型证实曲尼司特可以抑制心肌纤维化。九核受体激动药和激动药,详见下一部分。三过氧化物酶体增殖剂激活型受体年等首先发现了一种新的核受体,它能被过氧化物酶体增殖剂 ,激活,而被命名为过氧化物酶体增殖剂激活型受体 ,。还能被脂肪酸及其代谢产物激活而被称为脂肪酸受体。迄今为止,哺乳动物中已发现种亚型:./和。各亚型结构相似,但组织分布和配体有所差异【】。结构模式见图,可分为个结构域或个功能域。氨基端的/区是调节域;中部的区是结合域;区是连接域:羧基端的/区是配基结合域。主要分布在肝脏、心脏、肾脏和褐色脂肪组织,是贝特类药物如非诺贝特作用靶点;.主要分布在脂肪组织中,是噻唑烷二酮类化合物如罗格列酮作用靶点;毋/分布较为广泛,没有组织特异性,、和是其特异性配体。图 的结构模式图属于型核受体,小分子的激动剂进入细胞核内后,结合到的上,激活。目前认为活化的可能通过两种机制一转录激活和转录抑制机制而发挥作用,具体作用模式见图。配体激活的首先与核内的维甲酸受体结合形成异源二聚体,特异性地结合靶基因启动子中的反应元件,促进目的基因转录,发挥相应的作用,这种作用机制称之为转录激活。另外,活化的不与结合,通过蛋白一蛋白日】相互作用,调节核因子,、激活蛋白一,、信号转导子和转录激活等的活性,影响相应基因的转录,从而发挥作用,这种作用机制称之为转录抑制【.。审琴审.:敲矗。孟鬟念毒 筝声效盔孙一.冀,了,茧,一舻耐口舛. 最 图 弛的作用模式图配体激活后的可能对某些细胞的生长、分化甚至凋亡产生重要的影响。文献表明与动脉粥样硬化、高血压、心肌肥大和心肌纤维化等心血管疾病、糖尿病、肥胖和某些肿瘤细胞的生长有密切关系陆。四与心肌纤维化目前有关心肌纤维化治疗的研究较多,但绝大多数药物都处在细胞和动物实验阶段,仅有少数药物进入临床试验阶段,但效果并不令人满意【】。因此,研发新的抗心肌纤维化药物成为人们迫切的要求。中山大学博士学位论文/激活对大鼠心肌成纤维细胞胶原表达和细胞增殖的影响近年来,与心肌纤维化的关系越来越受到人们的关注。大量的研究证实,激动药具有抗心肌纤维化的作用。等卵采用灌注的大鼠研究了激动药非诺贝特对心肌纤维化和心肌炎症的影响。非诺贝特通过降低的活性,减少致炎因子.、.、和.的生成,从而抑制诱导的大鼠心肌胶原蓄积和心肌炎症。等】研究表明非诺贝特能够抑制腹主动脉缩窄大鼠和盐大鼠的心肌纤维化。前者与非诺贝特抑制.活性,减少生成量有关。后者与非诺贝特抑制.活性,减少致炎因子.,、.和.的生成有关。石榴花提取物是和的双重激动剂,通过调节.的活性可以减轻糖尿病脂肪大鼠的心肌纤维化四.一系列体内外实验表明,激动药可以抑制心肌纤维化。等发现罗格列酮减轻盐大鼠心肌纤维化的作用部分与其降低.活性、减少的生成量有关。缺氧复氧可以刺激增殖、型胶原表达和表达,这可能与缺氧复氧增加细胞活性氧,的生成有关眦】。匹格列酮通过减少的生成,降低.的活性,可以抑制缺氧复氧刺激的增殖和胶原表达【,】。大量文献表明,可以促进胶原表达诱导细胞产生有关口?,嘲。和细胞增殖【槔蛔,这些作用可能与等【例研究发现匹格列酮可以抑制诱导的细胞型胶原和.表达,这与匹格列酮减少细胞的生成,抑制.的激活有关。匹格列酮与帕伐他增加,抑制细胞的激活、细胞增汀合用可以调节诱导的殖和型胶原表达。综上,和激动药可以抑制心肌纤维化,这可能与药物抑制生成和或调节与和的相互作用有关。心脏表达/,而且邓/的配体结合域和结合域与和有%.%的同源序列四,但/激活是否可以抑制心肌纤维化尚未见文献报道。目前,有关的研究主要集中在和,而/研究相对较少。这可能与/非特异性分布,无激动药上市,以及选择性激动剂、.和等出现较晚年有关。相关研究表明,激动剂可以上调心肌细胞的过氧化物酶,抑制诱导的心肌细胞凋亡【。另外,研究发现激活的/可以与.或.相互作用,从面抑制心肌细胞肥大他切。以上文献提示/撤活可能具有调节、?和?的作用。由此,我们提出了设想:激活的也可能具有抑制心肌纤维化的能力。五研究内容本研究旨在细胞水平模拟心肌纤维化。探索.倍激活对诱导的成年大鼠胶原表达和细胞增殖的影响及其可能的机制,为心肌纤维化的治疗提供新的作用靶点,以有利于抗心肌纤维化药物的研发.图是本研究的流程图.据图,本课题的研究内容可以分为以下四部分:第部分成年大鼠心肌成纤维细胞/的表达情况第部分对诱导的细胞胶原表达和细胞增殖的影响第部分/激活与对心肌成纤维细胞的效应第部分初步探讨,激活所产生效应的机制/甲一圆隧固图研究流程图第章成年大鼠心肌成纤维细胞/的表达情况年等首先发现了一种新的甾体激素类受体,它能被过氧化物酶体增殖剂激活,而被命名为过氧化物酶体增殖剂激活型受体,。目前,哺乳动物中已发现种亚型:,/和叮【町。/体内分布广泛,在心脏、骨骼肌、肝脏和小肠中表达水平较高;在内皮细胞、淋巴细胞、单核/巨噬细胞和胶质细胞中也有表达。心脏主要由心肌细胞和组成。心肌细胞占心脏总体积的%,细胞数占心脏细胞总数的/。心肌细胞表达/,目前有关心肌细胞/的研究开展较多【“?彻。约占心脏细胞总数的%,但是否表达邢/至今尚未见报道。本实验体外成功地培养了成年大鼠,并在此基础之上研究了成年大鼠是否表达/。材料与方法一材料实验动物雄性大鼠,体重范围:?,中山大学实验动物中心提供。.天的乳鼠,中山大学实验动物中心提供。主要试剂培养基 美国公司小牛血清 美国公司胶原酶 美国公司胰蛋白酶美国公司酶美国公司美国公司美国公司双抗美国公司粉 武汉博士德公司粉美国公司免疫组化试剂盒 北京中杉金桥公司显色试剂盒 北京中杉金桥公司抗体美国公司因子抗体美国公司抗体美国公司试剂美国公司逆转录酶 大连宝生物公司大连宝生物公司酶抑制剂 大连宝生物公司大连宝生物公司北京普利莱生物公司核蛋白提取试剂盒 美国公司蛋白定量试剂盒 美国公司膜 美国.公司/抗体 美国公司.抗体美国公司偶联的二抗 美国公司蛋白分子量 美国公司二抗美国公司化学发光剂 美国公司国产其他常规试剂试剂配制.细胞培养主要试剂配制干粉型培养基,水洗培养基培养基:超纯水溶解.包装袋内面两次并倒入培养液中,磁力搅拌使干粉完全溶解,加水至,加.,加双抗,调整值至.,加水定容至,.滤膜过滤除菌后分装,保存.双抗溶液:使用浓度青霉素为/,链霉素/,配成贮存液,.贮存。缓冲液将一包粉,溶解于超纯水中,调节值至.。.滤膜过滤除菌后分装,。保存。.%胰酶称取胰蛋白酶.,加入中,磁力搅拌使其完全溶解,.滤膜过滤除菌,分装,.保存。溶液: 粉,加入超纯水中,磁力搅拌使其称取完全溶解,不调值,备用。液中,磁力搅拌使其.%胶原酶:称取胶原酶,加入完全溶解,调节值至.,.滤膜过滤除菌,分装,贮存。.主要试剂配制溶液:砀乙酸 .吣以. 拉些奎兰竖主堂垡堡壅垒曼堡塑堡翌盔垦:鱼盟盛堑笙塑堕壁堕耋垄塑塑堕堂堕塑堑堕加双蒸水至,混匀,分装,室温保存。溶液: 双蒸水混匀后,室温保存,备用。上样缓冲液:.%溴酚蓝,.%甲苯青,%甘油。%琼脂糖胶:琼脂糖.,加入溶液,加热溶解,待温度降至时,加入.,混匀。. 主要试剂配制/单体贮液%:.先用双蒸水溶解,搅拌直到溶液变成透明,再用双蒸水稀释至,滤纸过滤,棕色瓶保存在。. ?:.蒸馏水溶解后,用浓盐酸调至.,最后用蒸馏水定容至,保存。. ?:蒸馏水溶解后,用浓盐酸调至.,最后用双蒸水定容至,保存。%蒸馏水 轻柔搅拌,待溶解后,用双蒸水定容到。中山大学博士学位论文/激活对大鼠心肌成纤维细胞胶原表达和细胞增殖的影响%过硫酸胺过硫酸胺.双蒸水 .溶解后即可使用,最好现用现配。%分离胶和%浓缩胶%分离胶两块胶, %浓缩胶两块胶,超纯水. .%/ . . .%加后,立即混匀即可灌胶。蛋白电泳上样缓冲液:. . .溴酚兰.甘油混匀后,分装于.离心管中,室温保存。电泳液:.先用双蒸水溶解,搅拌直到溶液变成透明,加双蒸水稀释至。电转液:.先用双蒸水溶解,搅拌直到溶液变成透明,在用双蒸水稀释至.用前加甲醇。缓冲液:.加双蒸水至,用盐酸调至.。缓冲液:混匀后即可使用,最好现用现配。%封闭液:脱脂奶粉溶解在 .缓冲液。抗体洗脱液.一巯基乙醇加双蒸水至,混匀,最好现用现配。主要仪器双人单面超净工作台 苏州净化设备有限公司培养箱 美国公司倒置显微镜 德国公司加热磁力搅拌器 德国公司培养板/瓶/皿美国公司电子分析天平瑞士公司计瑞士公司冷冻高速离心机酶标仪美国.公司超低温冰箱日本公司紫外可见光光度计美国公司型电泳仪 北京六一仪器厂系列仪 美国公司 美国.公司电泳系统 美国.公司?电转系统美国.公司一成像系统美国公司分析软件 美国公司二方法成年大鼠培养利用本室建立并已发表的方法分离及培养成年大鼠取?雄性大鼠,颈椎脱臼法处死,用%的酒精消毒后,无菌条件下开胸取出心脏,放入溶液中。心脏经冲洗后,分离去除心房和大血管,把心脏剪成约的碎块。冲洗心脏碎块,瞬时离心,弃上清。将心肌组织移至含有小磁珠的锥形瓶中,加入 .%的胶原酶,置于加热磁力搅拌器上,水浴消化。离心,去上清,生奎兰堡三堂垡堡塞坠垦鲢亟适墅盔墼:垒巫壁堑丝塑堕壁堕耋垄塑塑堕堂堕堕堑堕洗涤沉淀,离心,收集沉淀。沉淀转移至含有小磁珠的锥形瓶中,加入 .%的胰酶,将锥形瓶嚣于加热磁力搅拌器上水浴消化。收集细胞上清至含等量%小牛血清的培养液中。离心,弃上清液,沉淀中加入含%小牛血清的培养液.毫升重悬细胞。剩余未消化的组织块继续加入胰酶消化。如此重复.次。收集各次消化所得的细胞悬液至一离心管中,离心,收集沉淀,加入 %的胶原酶,吹打,消化。离心,去上清,用含%小牛血清培养液重悬细胞,接种细胞于培养瓶中,、%孵育。轻柔冲洗细胞.次,更换新的培养基。细胞每.天换液次,常规培养,一股天传代次。乳鼠心肌细胞原代培养利用本室建立并已发表的乳鼠心肌细胞改良法分离及培养心肌细胞【彻。取.天乳鼠,用%的酒精擦洗胸部及腹部皮肤后,开胸,取出心脏,放入预冷的溶液中。继续处理余下的乳鼠。将所有心脏全部移至另一个盛有冷的平皿中,用镊子剔除心脏上的结缔组织后把心脏剪成的碎块。将心脏碎块连同吸至一离心管中,瞬时离心后将上清弃去,再在组织沉淀中加冷的,离心弃上清。.%的胰蛋将剪碎的心肌组织移至含有磁珠的锥形瓶中,加入白酶。于冰上静置.每隔三分钟摇一次锥形瓶。后锥形瓶置加热磁力搅拌器上水浴消化。后收集上清至含等量%小牛血清的冷培养液中。离心,弃上清液,沉淀中加入含%牛血清的培养液.毫升重悬细胞。剩余未消化的组织块继。如此重复?次。续加入胰酶消化,并在消化液加入./收集各次消化所得的细胞悬液至一离心管中,静置,自然沉降混入的未消化的组织块,然后轻轻吸取细胞悬液至另一离心管中,离心后用%牛血清重悬细胞,接种细胞于培养瓶中,%孵育.孵育.后,小心收集培养瓶中富集心脏细胞的上层细胞悬液,根据实验需要计数种板,在培养的培养液中加入. 以抑制生长。鉴定目前的鉴定多采用三因子法,即抗、因子和抗体鉴定法。本实验中,乳鼠心肌细胞作为小的阳性对照。操作步骤按照中杉金桥公司免疫组化染色试剂盒说明书进行,具体如下:取出培养天的成纤维细胞爬片,使其浸泡于溶液中次,每次。用%多聚甲醛溶液固定,室温风干后蒸馏水洗次。将%过氧化氢去离子水孵育以灭活内源性过氧化物酶,双蒸水洗次,每次。溶液。室温孵育。在玻片上滴加用稀释的%洗次,每次。滴加试剂封闭液,室温放置,甩去多余液体,不洗。滴加适当稀释度的一抗,:、因子:、:,室温.或过夜.洗次,每次。滴加试剂,室温放置,洗次,每次.滴加试剂,室温放置.,洗次,每次。显色:取蒸馏水,加入试剂盒中、试剂各滴,混匀后加至标本,室温显色,镜下控制显色时间。蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染,再用%、%、%、%的酒精溶液系列洗脱,二甲苯透明,封片。显微镜下观察,计数阳性细胞。生长曲线绘制第、代细胞生长曲线。生长良好的第、代细胞经胰酶消化成细胞悬液,按./密度接种于孔板,每消化三孔细胞,计数取平均值。以培养时间鬟横坐标,细胞数为纵坐标,绘制生长曲线。测定表达情况.总提取按说明书步骤提取总:孔板内细胞弃去培养基,洗涤一遍。每孔加入 ,吹打细胞,转入.管,室温静置。加入氯仿,剧烈振荡,室温静置。,离心,将上层水相转入另一管。加入异丙醇,混匀,室温静置。离心,弃上清,留沉淀。%乙醇洗涤沉淀遍。离心,室温干燥。水, 水浴溶解。加入.总的鉴定. 浓度和纯度.%水稀释倍后,分别测样品取 样品,用的、波长下的值,按以下公式计算浓度和纯度:浓度蚓“纯度/比值为.,说明纯度较高,没有蛋白质的残余比值小于.,说明样品中有蛋白质、酚等污染.鉴定质量配制%胶,取样品.与上样缓冲液:混匀,上样,以为缓冲液电泳,电泳。紫外灯下观察,可见、三条带。.逆转录合成参照公司试剂盒说明书,反应体系如下:成分 用量嗵盯甲 “.代.样品咖水将反应管置入仪中,按以下设置参数进行逆转录反应:,逆转录产物.保存或直接用于。.扩增和引物信息坐盔堂堡主堂垡鲨奎 坠垦堕塑适堕盔垦:堂盟盛堑丝塑堕堕堕耋垄塑塑墼塑堕堕墅堕参照公司试剂盒说明书,反应体系如成分 用量. 酶/ 上游引物.下游引物水“反应条件,。产物电泳分析取 产物与 上样缓冲液混合后上样于%琼脂糖凝胶,同时以 点样,以为缓冲液电泳。电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的/后,紫外灯下观察,拍照并进行图像分析。检测/表达.核蛋白的提取按公司核蛋白抽提试剂盒的说明书进行,所有步骤均在冰上操作,主要步骤如下:以%接种于培养皿中,细胞生长至%融合状态时,培养。弃培养液,用冷洗次细胞,用少量刮下细胞,离心。估计沉淀细胞的体积,加入含.的 “和,轻轻重悬沉淀,避免泡沫形成。.,.,涡旋。冰上孵育,加入 / 坠曼堕塑量墅盔基:垒墼鏖堑丝塑堕堕堕耋垄塑塑堕垄堕盟丝堕些盔堂堡主兰垡迨奎.离心,取上清得胞浆蛋白,沉淀为细胞核。. 重悬加入 和肛每含胞核,裂解.,在裂解的过程中要不断涡漩。.,. . %/ 甘油离心,取上清即为核蛋白。核蛋白.冻存,备用.蛋白含量的测定.制作蛋白标准曲线,室温融化后,备用。混合混合液,份溶液取出/与份溶液混合。取孔板,按下表在各孔中依次加入各种试剂。混匀后,保温,酶标仪测定吸光度,绘制蛋白标准曲线。.检测样品蛋白含量取分装后的蛋白,室温溶解,分别稀释倍,每孔加稀释后的样本,加混合液,每个稀释样本加两个孔。混匀后,保温,酶标仪上进行测定,利用蛋白标准曲线计算样品浓度。. 检测样品前处理:各组样品上样量均为斗,用裂解液将各管体积补齐,样品热,迅速冰上冷却,与蛋白上样缓冲液以:体积混合,中山大学博士学位论文/激活对大鼠心肌成纤维细胞胶原表达和细胞增殖的影响,离心。配置%分离胶和%的浓缩胶详见试剂配制部分。.电泳:每孔上样,浓缩胶电压,当染料前沿进入分离胶后,将电压提高到,继续电泳至溴酚兰到达分离胶底部。转膜:凝胶与膜接触,然后将凝胶与之相贴的膜加于滤纸问,用海绵垫和筛孔板固定好,插入电转槽中,加入电转液,保证凝胶在负极,膜在正极方向。室温或电转过夜。封闭:将膜置于%封闭液中,室温封闭。洗次,每次。加一抗:将/抗体用封闭液稀释至:.均匀覆盖于膜表面,。孵育过夜。洗次,每次。加二抗:将二抗用封闭液稀释至:,均匀覆盖于膜表面,室温下孵育。洗次,每次。显影:配置发光液,将溶液和溶液等体积均匀混合。在暗室中,将该混合液 滴加于膜上,后,弃去过量的液体。将膜包于保鲜膜中,注意避免产生皱折和气泡,放入光片夹中。将光片放在膜上,压片时间一般为,显影,定影。,蛋白检测:用抗体洗脱液将膜浸渍,放在脱色摇床上缓摇洗次,余下的步骤同前.,稀释度:。条带分析:摄取光片图象,用软件对条带进行分析。统计分析.统计软件进行数据处计量资料以均数标准差表示,采用理,两组间比较采用检验;多组问比较采用单因素方差分析,多组均数间两两比较采用检验,.表示差别有统计学意义。结 果成年大鼠生长观察刚消化分离下来的细胞呈亮球形,轮廓清晰,单个或聚集成细胞团。接种后即有大量细胞贴壁,其中部分己开始伸展,表现为轮廓渐模糊,有小的细胞突起。.后大多数贴壁细胞己伸展呈梭形。.后细胞散在生长,除贴壁的细胞团外,一般不形成集落。.可生长成细胞单层,漩涡状排列或纵横交为原代倒置显微镜下观察的结果,错,贴壁的细胞团呈放射状生长。原代培养的呈梭形或不规则三角形,胞质淡而几乎透明,细胞核较大,呈椭圆形,通常含.个核。无自发性搏动。传代细胞贴壁、伸展速率更快,多数细胞在即开始伸展。在%的接种密度及%新生小牛血清的条件下,约基本长成细胞单层。随着传代次数的增加,细胞生长开始变慢,并出现一些体积较大、扁平伸展的细胞。鉴定为免疫细胞化学法鉴定细胞的结果。细胞阳性,证明所得细胞来源于间充质。细胞因子阴性,证明所得细胞非内皮细胞。细胞阴性,证实所得细胞非心肌细胞,而作为阳性对照的乳鼠心肌细胞.阳性。综上,培养所得细胞为。随机选取个视野分别计数细胞总数和阳性细胞数,求平均值后,计算阳性细胞百分率。采用本文所述方法获得的纯度可以达到%以上。生长曲线.。从图中可以清楚看到,尽管随着传代第代的生长曲线见次数的增加,细胞生长开始变慢,但第代细胞的生长特性无明显差别,三者的生长曲线基本一致。以/的密度接种细胞,约后进入对数生长期,基本融合成细胞单层,后出现接触抑制现象。的;/表达情况为成年大鼠邓/的表达情况,其中乳鼠心肌细胞作为/表达的阳性对照。如图所示,成年大鼠在和蛋白两个水平都检测到/表达。的/ 和蛋白表达量都较心肌细胞低.。的表达情况。如图所示,成年大鼠中各亚型的表达情况见中个亚型同时表达,其中,表达量最低,/和表达量较高. .。