分解纤维素的微生物的分离 上课用精讲

教学目标教学目标:1、知道纤维素酶的种类及作用、知道纤维素酶的种类及作用2、初步掌握从土壤中分离出分解纤维、初步掌握从土壤中分离出分解纤维 素的微生物的实验方法素的微生物的实验方法纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素真菌、放线菌及细菌真菌、放线菌及细菌纤维素酶纤维素酶下列生物能分解纤维素的是（下列生物能分解纤维素的是（ ） 人人 兔兔 牛牛 蘑菇蘑菇 纤维杆菌纤维杆菌A. B.C. D.C兔、牛等草食性动物的肠胃中的共生微生物可兔、牛等草食性动物的肠胃中的共生微生物可合成纤维素酶分解纤维素。合成纤维素酶分解纤维素。蘑菇、纤维杆菌能分泌纤维素酶分解纤维素；蘑菇、纤维杆菌能分泌纤维素酶分解纤维素；人不能消化纤维素。人不能消化纤维素。在一支试管中添加纤维素酶，在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；另一支试管不添加纤维素酶；思考思考1P27的小实验是如何构成对照的？的小实验是如何构成对照的？滤滤纸纸崩崩溃溃法法4 4、纤维素酶活性的测定实验：、纤维素酶活性的测定实验： 方法：滤纸崩溃法方法：滤纸崩溃法（二）纤维素分解菌的筛选（二）纤维素分解菌的筛选1、筛选纤维素分解菌的方法、筛选纤维素分解菌的方法_。优点：该方法可以通过优点：该方法可以通过_反应直接筛选。反应直接筛选。刚果红染色法刚果红染色法颜色颜色2、其原理是：、其原理是：刚果红刚果红可以与可以与纤维素纤维素形成形成_，当纤维素被，当纤维素被_分解后，分解后，红色复合物无法形成，出现以红色复合物无法形成，出现以_为中心的为中心的_，可以通过，可以通过_ 来筛选纤维素分解菌。来筛选纤维素分解菌。红色复合物红色复合物纤维素酶纤维素酶纤维素分解菌纤维素分解菌 透明圈透明圈是否产生透明圈是否产生透明圈可根据是否可根据是否产生产生透明圈透明圈来筛选纤维来筛选纤维素分解菌素分解菌透明圈大的，透明圈大的，分解纤维素的分解纤维素的能力就强啦能力就强啦练一练：练一练：1、下列关于纤维素酶的说法，错误的是、下列关于纤维素酶的说法，错误的是A、纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种、纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B、纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖、纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C、纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁、纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D、葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖、葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖2、利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，、利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是下列说法错误的是A、刚果红能与纤维素形成红色复合物、刚果红能与纤维素形成红色复合物 B、刚果红能与纤维二糖形成红色复合物、刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C、刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物、刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D、若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出、若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌了纤维素分解菌( (三三) )、实验设计、实验设计土壤土壤取样取样选择选择培养培养梯度梯度稀释稀释将样品涂将样品涂布到鉴别布到鉴别培养基培养基挑选挑选菌落菌落什么样什么样的环境的环境取样取样? 培养的目的培养的目的? ? 选择培养基的选择培养基的特点特点? ?挑选什挑选什么样的么样的菌落菌落? ?鉴别培养基鉴别培养基的特点的特点? ?如何鉴别如何鉴别? ?根据根据：微生物：微生物对生存环境的对生存环境的要求，到相应要求，到相应环境中去找；环境中去找；目的：目的：增加纤维素增加纤维素分解菌的浓度，分解菌的浓度，以以确保能够从样品中确保能够从样品中分离到所需要的微分离到所需要的微生物；生物；刚果红染色法刚果红染色法( (三三) )、实验设计、实验设计土壤土壤取样取样选择选择培养培养梯度梯度稀释稀释将样品涂将样品涂布到鉴别布到鉴别培养基培养基挑选挑选菌落菌落旁栏思考旁栏思考1本实验流程与尿素分本实验流程与尿素分解菌的分离实验流程有哪些异同？解菌的分离实验流程有哪些异同？尿素分解菌的分离实验流程是将土样制成的尿素分解菌的分离实验流程是将土样制成的菌悬液直接涂布在选择培养基上；菌悬液直接涂布在选择培养基上；本课题通过选择培养使细菌增殖后，再涂布本课题通过选择培养使细菌增殖后，再涂布在鉴别培养基上。其它操作基本基本相同。在鉴别培养基上。其它操作基本基本相同。 选择纤维素丰富的环境选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。 生物与环境的互相依存关系，在富含纤维生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于获得目的微生物的几率要高于普通环境普通环境旁栏思考旁栏思考2 取样的环境是怎样的，作出这取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？种选择的理由是什么？根据根据微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找；微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找；【资料一资料一】土壤取样土壤取样 人工设置适宜环境，使纤维人工设置适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。素分解菌相对聚集。 将纸埋于深约将纸埋于深约10cm的腐殖土的腐殖土壤中。壤中。旁栏思考旁栏思考3将滤纸埋在土壤中有什么作用？将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？你认为滤纸应该埋进土壤多深？ 选择培养的选择培养的 【资料二资料二】选择培养选择培养培养基成分分析培养基成分分析培养基组成培养基组成提供主要的营养物质提供主要的营养物质纤维素粉纤维素粉 5g碳源（能源）碳源（能源）NaNO3 1g氮源、无机盐氮源、无机盐KCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g无机盐无机盐酵母膏酵母膏 0.5g生长因子、生长因子、碳源碳源、氮源、氮源水解酵素水解酵素 0.5g氮素、生长因子氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至溶解后，蒸馏水定容至1000mL水水有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能有选择作用，本配方中纤维素作为主要碳源，只有能分解纤维素的微生物可以大量繁殖。分解纤维素的微生物可以大量繁殖。（2）若设置一个对照实验说明选择培养）若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将的作用，应控制的变量是将_改为改为_。C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？的作用？葡萄糖葡萄糖纤维素粉纤维素粉用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照答：（答：（1）自变量为培养基的种类，即普通）自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基培养基和选择培养基在选择培养的条件下，可以使那些能够适应在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到制，因此可以起到“浓缩浓缩”的作用的作用旁栏思考旁栏思考4为什么选择培养能够为什么选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？【资料三资料三】刚果红染色法刚果红染色法方法一：方法一：先培养微生物，再加入刚果先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应红进行颜色反应方法二：方法二：在倒平板时就加入刚果红在倒平板时就加入刚果红漂洗作用漂洗作用,氯化钠可以使结合不牢的刚果红洗去氯化钠可以使结合不牢的刚果红洗去,这这样就留下大大小小的透明圈样就留下大大小小的透明圈,大的透明圈当然分解大的透明圈当然分解纤维素的能就强。纤维素的能就强。方法一中方法一中NaCl溶液的作用？溶液的作用？培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的主要营养物质CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源、氮源、生长因子碳源、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源、生长因子碳源、生长因子琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸上述物质溶解后，加蒸馏水定容至馏水定容至1000mL氢元素、氧元素氢元素、氧元素鉴别鉴别纤维素分解菌的培养基纤维素分解菌的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠水溶性羧甲基纤维素钠)染色法染色法优点优点缺点缺点颜色反应基颜色反应基本上是纤维本上是纤维素分解菌的素分解菌的作用作用操作繁琐操作繁琐刚果红会使菌落之间发刚果红会使菌落之间发生混杂生混杂操作简便操作简便不存在菌落不存在菌落混杂问题混杂问题 产生淀粉酶的微生物产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，也产生模糊透明圈， 有些微生物能降解色素，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。形成明显的透明圈。思考：这两种方法各有哪些优点与不足思考：这两种方法各有哪些优点与不足方法一：方法一：先先培养微生物，培养微生物，再加入刚果再加入刚果红进行颜色红进行颜色反应反应方法二：方法二：在在倒平板时就倒平板时就加入刚果红加入刚果红挑选产生透明圈的菌落挑选产生透明圈的菌落 挑取产生挑取产生明显的透明圈的菌落，明显的透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。一般即为分解纤维素的菌落。 接种到接种到纤维素分解菌的纤维素分解菌的选择选择培养培养基上，在基上，在30300 0C C37370 0C C培养，可获得纯培养，可获得纯培养。培养。练一练练一练 1、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪、在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合下列哪 一生物学观点？（一生物学观点？（ ）A.生物结构与功能相适应的观点生物结构与功能相适应的观点 B.生物结构与功能整体性观点生物结构与功能整体性观点C.生物与环境相适应的观点生物与环境相适应的观点 D.生物发展进化的观点生物发展进化的观点2、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是（ ） 土壤取样土壤取样 梯度稀释梯度稀释 选择培养选择培养 菌悬液涂布平板菌悬液涂布平板 挑选出单个菌落挑选出单个菌落 A、 B、 C、 D、3、有关选择培养正确的叙述是（、有关选择培养正确的叙述是（ ）A、可以增加纤维素分解菌的浓度、可以增加纤维素分解菌的浓度B、可以减少纤维素分解菌的浓度、可以减少纤维素分解菌的浓度C、所用培养基是固体培养基、所用培养基是固体培养基D、所用培养基是平板培养基、所用培养基是平板培养基CBA四、结果分析与评价四、结果分析与评价 1.1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。培养基制作合格。 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。了分解纤维素的微生物。 2.2.分离的结果是否一致分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。等不同的分离结果。 1.为了确定分离得到的是纤维素分解菌，为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行还需要进行_实验，纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有发酵方法有_ _ 发酵和发酵和_ _ 发酵。发酵。2.2.纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的纤维素所产生的_ _ 含量进行定量测定。含量进行定量测定。发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶 液体液体 固体固体 五、课题延伸五、课题延伸分解分解纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化种类、作用、催化刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养涂布培养涂布培养纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌课堂总结课堂总结比较项目比较项目 分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基培养基类型类型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择尿素做氮源的选择培养基上培养基上将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源的纤维素粉做碳源的选择培养基上选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养选择培养,浓缩所需微生物浓缩所需微生物比较比较项目项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养原理原理培养基类培养基类型型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原原理理现现象象方方法法在细菌分解尿素的化学反应在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，的碱性增强，pHpH升高。在培升高。在培养基中加入酚红指示剂，如养基中加入酚红指示剂，如果果pHpH升高指示剂会变红升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形成刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈菌为中心的透明圈观察菌落周围是否有着色的观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌环带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌透明圈来筛选纤维素分解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法 【练一练练一练】 有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究和作用，使人们能够利用秸秆等微生物的研究和作用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。研究人员用化合物研究人员用化合物A、硝酸盐、磷酸盐以及微、硝酸盐、磷酸盐以及微量元素配制的培养基，成功的筛选到能产生纤量元素配制的培养基，成功的筛选到能产生纤维素酶的微生物。分析回答问题。维素酶的微生物。分析回答问题。 (1)培养基中加入的化合物培养基中加入的化合物A是是_，为微，为微生物的生长提供生物的生长提供_，这种培养基属于，这种培养基属于_培养基。培养基。 (2)为了筛选出能产生纤维素酶的微生物，向培为了筛选出能产生纤维素酶的微生物，向培养基中加入养基中加入_。纤维素纤维素碳源碳源选择选择刚果红刚果红 (3)在筛选出能产生纤维素酶的微生物之前，可在筛选出能产生纤维素酶的微生物之前，可用液体培养基培养，增加微生物的浓度。为获得用液体培养基培养，增加微生物的浓度。为获得纯净的菌株，常采用平板划线的方法进行接种，纯净的菌株，常采用平板划线的方法进行接种，此过程所用的接种工具是此过程所用的接种工具是_，操作时采，操作时采用用_灭菌的方法；还可用灭菌的方法；还可用_ 的的方法接种。方法接种。 (4)实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理后才能倒掉，这样做的目的是处理后才能倒掉，这样做的目的是 _。接种环接种环灼烧灼烧稀释涂布平板稀释涂布平板防止造成环境污染防止造成环境污染20092009年年40.40.【生物生物选修选修1 1生物技术实践生物技术实践】（1515分）分） （1 1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、_、_等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。 （2 2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行需对培养基和培养皿进行_（消毒、灭菌）；操（消毒、灭菌）；操作者的双手需要进行清洗和作者的双手需要进行清洗和_；静止空气中的细菌；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能能_。 温度温度酸碱度酸碱度易培养易培养生活周期短生活周期短灭菌灭菌消毒消毒损伤损伤DNADNA的结构的结构链接高考链接高考（3 3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的次重复外，还应保证待测样品稀释的_。（。（4 4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的等菌落特征对细菌进行初步的_。（。（5 5）培）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是对于固体培养基应采用的检测方法是_。（6 6）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过培养物必须经过_处理后才能丢弃，以防止培处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。养物的扩散。比例合适比例合适鉴定（或分类）鉴定（或分类）将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间, ,观观察培养基上是否有菌落产生察培养基上是否有菌落产生. .灭菌灭菌1111年年39.39.【生物生物 选修选修1 1：生物技术实践（：生物技术实践（1515分）分）有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从污染的土壤中筛选出高的土壤污染。某同学欲从污染的土壤中筛选出高效降解原油的菌株。回答问题：效降解原油的菌株。回答问题：在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以 为唯一碳源的固体培养基上，为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于从功能上讲，该培养基属于 培养基。培养基。纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即方法有两种，即 和和 。 石油石油选择选择平板划线法平板划线法稀释涂布平板法稀释涂布平板法为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力 。通常情况下，在微生物培养过程中实验室常用通常情况下，在微生物培养过程中实验室常用的灭菌方法有的灭菌方法有 、 和和 。无菌技术要求试验操作应在酒精灯无菌技术要求试验操作应在酒精灯 附近附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。进行，以避免周围环境中微生物的污染。强强灼烧灭菌灼烧灭菌干热灭菌法干热灭菌法高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法火焰火焰