愈伤组织培养

第二章 愈伤组织培养愈伤组织培养 主要教学内容 愈伤组织的诱导与分化 愈伤组织的继代培养 愈伤组织的形态发生及调控 愈伤组织培养的应用 愈伤组织 一、愈伤组织的诱导与分化 愈伤组织，原是指植物受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中，则指外植体的增生细胞产生的一团不规则、疏松的薄壁细胞。 一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织。 由外植体形成愈伤组织，标志着组织培养的开始。 愈伤组织的形成条件 一个成熟的植物细胞经历了脱分化之后，之所以还能再分化而形成完整的植株，是因为这些细胞具有全能性。 外植体的选择与灭菌 植株茎的切段、叶、根、花和种子，或把其中的某些组织切成片或块状等均可作为外植体。 植物生长调节物质 通常情况下，诱导愈伤组织的培养基中都含有较高浓度的生长素(如2,4-D)和较低浓度的细胞分裂素(如6-BA)。 愈伤组织诱导成败的关键主要受外植体的类型及培养基组成，特别是激素的种类和浓度水平的影响。 1、植物愈伤组织的形成结构 根据愈伤组织的性质和细胞组成的特点，可以将它们的结构分为致密和松散两种类型。 致密型 松散型 2、愈伤组织形成的过程愈伤组织形成的过程 外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划分为四个时期，即诱导期、分裂期、形成期和分化期。 诱导期： 是细胞准备进行分裂的时期。 特点：代谢活化了，细胞内的合成代谢迅速进行，但细胞的大小和外植体时一样，没有多大改变。 诱导期的长短： 由一系列内部（植物种类、生理状况）和外部因素（光照、外源激素）决定。 例如菊芋的诱导期有时还不需要1天，胡萝卜的诱导期则要好几天，但菊芋块茎经过5个月的贮藏后，诱导期则须延长到40h以上。 可以从内外因两方面着手，改变诱导期长短 外因：添加生长激素如2,4D来刺激处于静止状态的组织。 分裂期 是指细胞通过一分为二的分裂，不断增生子细胞的过程。 外植体的细胞一旦经过诱导，其外层细胞开始迅速分裂，使细胞脱分化。 在细胞分裂期，其形成结构和生理生化都发生深刻的变化： 1.数目迅速增加。 2.平均鲜重下降。 3.体积小，内无液泡。 4核和核仁增大到最大。 形成期 是指外植体经过诱导期和分裂期后形成了无序结构的愈伤组织的时期。 这一时期愈伤组织内细胞的特点是： 大而不规则，高度液泡化，整个组织是比较松散的。 细胞增殖速度快,适合用液体培养或悬浮培养。 生长旺盛的愈伤组织呈乳黄色或白色，有光泽，也有浅绿色或绿色的；老化的愈伤组织多转变为黄色甚至褐色。 愈伤组织形成 分化期 是指停止分裂的细胞发生生理代谢变化，导致形成由不同形态和功能的细胞形成的愈伤组织。 分化期的主要表现： 细胞分裂部位和方向发生改变。 分化组织瘤状结构和维管组织的形成。 体积不再减小。 出现各种类型的细胞。 二、愈伤组织的继代培养 愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养，即继代培养。 通过继代培养，可使愈伤组织无限期地保持在不分化的增殖状态。 由于代谢产物的积累会产生毒害作用，如果长时间不继代培养，就会使愈伤组织变成黑褐色，继而死亡。 用继代培养维持愈伤组织生长，是长期保存愈伤组织的一种方法。 一般来说，愈伤组织的增殖生长只发生发生在不与琼脂接触的表面，而与琼脂接触的一面极少细胞增殖，只是细胞分化形成紧密的组织块。因此，由于愈伤组织的迅速增殖，整个愈伤组织小方块变成了一个不规则的馒头状的组织块。 它是愈伤组织表面或近表面瘤状物生长的结果。 青苹果愈伤组织增殖培养 乌桕愈伤组织增殖培养 三三 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生 形态建成：外植体在适宜的培养条件下经过脱分化和再分化形成完整植株的过程。 在组织培养中，从外植体形成器官或无性系的形态发生，有下面两种方式： 不定芽方式 指愈伤组织通过再分化形成不定芽再生植株。这是组织培养中常见的器官发生方式。 愈伤组织的器官发生顺序有三种情况： （1）先形成芽，再在芽的基部长出根形成小植株。 （2）先产生根，再从根的基部分化出芽形成小植株； （3）仅单独分化根或芽，即无根的芽或无芽的根。 形态发生方式（一） 形态发生方式（二） 胚状体方式 指由培养细胞诱导分化出的胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。 四、愈伤组织形态发生的调控四、愈伤组织形态发生的调控 影响因子： （一）外植体本身 （二）培养基 （三）培养环境 1遗传型 材料的基因型对愈伤组织的器官分化有决定性的影响。 2器官和部位 对有些植物而言，不同的器官或组织所形成的愈伤组织，在生理上或形态上存在明显差异。 3年龄 年龄较幼的外植体，不仅易于诱导形成愈伤组织，而且也容易诱导分化成植株。 （一）外植体本身 1生长调节剂 细胞分裂素/生长素的比例是控制芽和根形成的重要条件之一。细胞分裂素/生长素比例高时有利于芽形成；而这一比例低时，有利于根的形成。 2无机营养元素 营养元素的缺失会导致愈伤组织生长不良，如： 缺铁：细胞分裂停止； 缺氮：细胞过度生长，形成层组织减退。 （二）培养基 3有机成分 在培养基中加入糖、各类B族维生素、肌醇和甘氨酸等，可以促进愈伤组织的生长和器官分化的要求。 4 物理性质 培养基的物理性质（固体或液体状态，渗透压等）对形态发生有明显的影响。如油菜花药培养宜先在高糖（9-10%）培养基中培养，有利于细胞增殖和胚状体的形成。 1光周期 在愈伤组织诱导阶段，一般采用三种做法：全暗、周期性光照、散射性光照来进行光照调节。 （三）培养环境 2、温度 在组织培养中，一般都采用252的恒温条件下进行外植体的培养都可较好地形成芽和根。 器官形成 胚形成 菊花叶片培养菊花叶片培养 愈伤组织形成 五、愈伤组织的应用 (1)加快了植物新品种和良种繁育速度 植物组织培养将传统的育种方式改在试管和室内进行，利用一块植物组织在一年内可繁殖成千上万株的小植株，取得迅速高效、低成本推广新品种的效果。 (2)利于种质资源保存和远距离运输 应用组织培养保存种质资源具有节约土地，节省人力、物力，手续简便，易于远距离运输，而且不受病虫害的侵袭，便于交流的优点。 （3）提供育种中间材料 通过组织培养可获得不同性质的愈伤组织，可为原生质分离、融合或遗传转化提供优质材料。 （4）可诱导和筛选突变体 （5）制造人工种子 为某些濒危和珍贵物种的繁殖，提供一种高效的手段。 复习思考题复习思考题 ？ 1、愈伤组织形态发生的影响因子有哪些？如何进行调节？ 2、愈伤组织培养在植物育种中的应用有哪几方面？