课题3 分解纤维素的微生物的分离

植物果实在收获以后，大量的秸秆、叶子剩余植物果实在收获以后，大量的秸秆、叶子剩余下来，不仅污染环境，而且造成了大量的浪费。下来，不仅污染环境，而且造成了大量的浪费。导入新课 植物的根、茎、叶植物的根、茎、叶等器官中都含有大量的等器官中都含有大量的纤维素，麻、棉花、麦纤维素，麻、棉花、麦秆、稻草、甘蔗渣等，秆、稻草、甘蔗渣等，都是纤维素的丰富来源。都是纤维素的丰富来源。一般木材中，纤维素占一般木材中，纤维素占4050%。 纤维素是一种重要的碳水化合物，土壤纤维素是一种重要的碳水化合物，土壤中的某些微生物能将其分解利用。中的某些微生物能将其分解利用。 这些微生物之所以能够将纤维素分解利用，这些微生物之所以能够将纤维素分解利用，是因为他们能够产生是因为他们能够产生纤维素酶纤维素酶。 为了能更好的应用这些微生物造福人类，我为了能更好的应用这些微生物造福人类，我们首先要将他们从土壤环境中种类众多的微生物们首先要将他们从土壤环境中种类众多的微生物中分离出来。中分离出来。 我们已经学习了怎样从土壤中我们已经学习了怎样从土壤中分离分解尿素的细菌，你能自己动分离分解尿素的细菌，你能自己动手设计从土壤中分离分解纤维素微手设计从土壤中分离分解纤维素微生物的方法吗？生物的方法吗？想一想想一想专题专题2 微生物的培养与应用微生物的培养与应用从土壤中分离分解维生素的微生物。从土壤中分离分解维生素的微生物。重点与难点（一）（一） 纤维素与纤维素酶纤维素与纤维素酶1、纤维素（、纤维素（cellulose）组成：组成：纤维素是由葡萄糖组纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖。成的大分子多糖。 分布：分布： 纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一类纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一类多糖，占植物界碳含量的多糖，占植物界碳含量的50%以上。棉花中纤维素以上。棉花中纤维素的含量接近的含量接近100%，是最纯的天然纤维素来源。，是最纯的天然纤维素来源。 作用：作用：纤维素在造纸业中大量使用，是重要的造纸原料。纤维素在造纸业中大量使用，是重要的造纸原料。 纤维素可以制成甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤纤维素可以制成甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、微晶纤维素等衍生物。维素、微晶纤维素等衍生物。食物中的纤维素（即膳食纤维）对人体的健康也有着食物中的纤维素（即膳食纤维）对人体的健康也有着重要的作用。重要的作用。纤维素纤维素纤维二糖纤维二糖C1酶、酶、Cx酶酶2、纤维素酶、纤维素酶纤维素酶是一种复合酶纤维素酶是一种复合酶组成组成 纤维素酶包括三种组成：纤维素酶包括三种组成： 外切酶（外切酶（C1酶）、内切酶（酶）、内切酶（Cx酶酶) 葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶纤维二糖纤维二糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶作用：作用： 内切酶作用于无定形的纤维素区域，使纤内切酶作用于无定形的纤维素区域，使纤维素断裂成片段；维素断裂成片段； 外切酶作用于纤维素的结晶区域或小片段外切酶作用于纤维素的结晶区域或小片段纤维素，产生纤维二糖；纤维素，产生纤维二糖； 纤维二糖再由葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。纤维二糖再由葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。 葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶内切酶内切酶外切酶外切酶内切酶内切酶葡萄糖葡萄糖（二）（二） 纤维素分解菌的筛选纤维素分解菌的筛选1、刚果红染色法、刚果红染色法 在含有纤维素的培养基中加入在含有纤维素的培养基中加入刚果红刚果红，在培养基表面生长的纤维素分解菌周围会在培养基表面生长的纤维素分解菌周围会产生以菌落为中心透明圈。产生以菌落为中心透明圈。方法一：方法一：先培养微生物，再加入刚果先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。红进行颜色反应。优点：这样显示出的颜色反应基本上是优点：这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。纤维素分解菌的作用。缺点：操作繁琐，加入刚果红溶液会缺点：操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂。使菌落之间发生混杂。方法二：方法二：在倒平板时加入刚果红。在倒平板时加入刚果红。优点：操作简便，不存在菌落混杂问题。优点：操作简便，不存在菌落混杂问题。缺点缺点1：由于在纤维素粉和琼脂、土豆汁：由于在纤维素粉和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。粉酶的微生物出现假阳性反应。缺点缺点2：有些微生物具有降解色素的能力，：有些微生物具有降解色素的能力，他们在长时间培养过程中会降解刚果红而他们在长时间培养过程中会降解刚果红而形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。区分。2、刚果红染色法的原理、刚果红染色法的原理 刚果红能与纤维素形成刚果红能与纤维素形成红色红色复合物，而不与复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生此反应。水解后的纤维二糖和葡萄糖发生此反应。 当在含有纤维素的培养集中加入刚果红时，当在含有纤维素的培养集中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红刚果红纤维素纤维素的复合物的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。分解菌为中心的透明圈。将样品涂布到鉴别纤维素分解将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上菌的培养基上土壤取样土壤取样选择培养选择培养梯度稀释梯度稀释分离分解纤维素微生物实验流程示意图分离分解纤维素微生物实验流程示意图挑选产生透明挑选产生透明圈的菌落圈的菌落讨论讨论 本实验的流程与课题本实验的流程与课题2中的实验流程中的实验流程有哪些异同？有哪些异同？ 答：课题答：课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。离得到菌落。 本实验通过选择培养，使纤维素分解菌得到本实验通过选择培养，使纤维素分解菌得到繁殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步繁殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。骤基本一致。具体操作步骤：具体操作步骤：1、土样采集、土样采集 方法与课题方法与课题2类似。土样采集要在富含类似。土样采集要在富含纤维素的环境中进行，如果找不到适合的环纤维素的环境中进行，如果找不到适合的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。也会有能分解纤维素的微生物生长。思考思考 为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？素分解菌？ 答：由于生物与环境的相互依存关系，答：由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。生物的几率要高于普通环境。思考思考 将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？滤纸应该埋进土壤多深？ 答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。适宜环境。 一般应将纸埋于深约一般应将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。的腐殖土壤中。2、选择培养、选择培养 称取土样称取土样20g，在无菌条件下加入装有，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。培养基的摇瓶中。30震荡培养震荡培养1-2天，天，至培养基变浑浊。进行梯度稀释和涂布平至培养基变浑浊。进行梯度稀释和涂布平板。板。纤维素粉纤维素粉5.0gNaNO31.0gKH2PO40.9gNa2HPO47H2O1.2gMgSO47H200.5gKCl0.5g水解酪素水解酪素0.5g酵母膏酵母膏0.5g蒸馏水蒸馏水1000mL纤维素分解菌的选择培养基配方纤维素分解菌的选择培养基配方鉴别纤维素分解菌的培养基配方鉴别纤维素分解菌的培养基配方CMC-Na5-10gKH2PO40.25g琼脂琼脂15g土豆汁土豆汁100mL酵母膏酵母膏0.5g蒸馏水蒸馏水1000mL3、 刚果红染色法分离纤维素分解菌刚果红染色法分离纤维素分解菌 将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作要求，在无菌培养皿中倒入要求，在无菌培养皿中倒入15-20mL培养基，培养基，凝固后待用。凝固后待用。 将选择培养后的培养基进行梯度稀释至将选择培养后的培养基进行梯度稀释至106。 将稀释好的菌悬液涂布在培养基上，进行将稀释好的菌悬液涂布在培养基上，进行培养至有菌落长出。同时设置对照。培养至有菌落长出。同时设置对照。1、复习微生物技术、复习微生物技术a培养基的配制培养基的配制b无菌操作技术无菌操作技术c稀释涂布平板法稀释涂布平板法d选择培养基的作用选择培养基的作用e土壤取样土壤取样2、选择培养的操作方法、选择培养的操作方法土样土样选择培养基选择培养基培养培养吸取部分吸取部分培养液培养液新鲜的选新鲜的选择培养基择培养基培养培养稀释涂布稀释涂布想想一一想想 为什么选择培养能够为什么选择培养能够“浓浓缩缩”所需的微生物？所需的微生物？ 答：在选择培养条件下，答：在选择培养条件下，可以使那些能够适应这种营养可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可微生物的繁殖被抑制，因此可以起到以起到“浓缩浓缩”的作用。的作用。视频一：视频一：分解纤维素的微生物的分离分解纤维素的微生物的分离1视频二：视频二：分解纤维素的微生物的分离分解纤维素的微生物的分离2视频三：视频三：分解纤维素的微生物的分离分解纤维素的微生物的分离31、培养基的制作是否合格以及、培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落？选择培养基是否筛选出菌落？u 对照的培养基在培养过程中没有菌落长对照的培养基在培养过程中没有菌落长出说明培养基制作合格。出说明培养基制作合格。u 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。可能获得了分解纤维素的微生物。2、分离的结果是否一致？、分离的结果是否一致？u 由于在土壤中细菌的数量远高于真菌和由于在土壤中细菌的数量远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。细菌。u 由于所取土样的环境不同，可能得到真由于所取土样的环境不同，可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。菌和放线菌等不同的分离结果。纤维素酶发酵方法纤维素酶发酵方法:液体发酵液体发酵固体发酵固体发酵纤维素酶测定方法纤维素酶测定方法: 对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定生的葡萄糖进行定量测定基础基础知识知识实验设计实验设计纤维素纤维素组成组成纤维素酶纤维素酶操作提示操作提示复习微生物技术复习微生物技术分布分布组成组成作用作用刚果红法刚果红法作用作用实验流程图实验流程图纤维素酶测定方法纤维素酶测定方法选择培养的操作方法选择培养的操作方法分解分解纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离 纤维素分解纤维素分解菌的筛选菌的筛选纤维素酶发酵方法纤维素酶发酵方法具体操作步骤具体操作步骤原理原理结果分析与评价结果分析与评价课题延伸课题延伸课堂小结2 答：流程图如下。答：流程图如下。土壤取样土壤取样选择培养（此步是否需要，应根选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量得多少来确定）据样品中目的菌株数量得多少来确定） 梯梯度稀释度稀释将菌悬液涂布到有特定选择作用的将菌悬液涂布到有特定选择作用的培养基上培养基上挑选单菌落挑选单菌落发酵培养发酵培养习题答案