伦敦大学帝国学院igem项目之 学习笔记

伦敦大学帝国学院igem项目之 学习笔记一：荒漠化土壤侵蚀和荒漠化是全球范围内的问题。导致耕地的损失，经济困难和环境退化。我们的项目侧重于解决这些严重问题的工程菌，以提高植物根系生长。我们正计划来实现我们的细菌带入一个种皮，以帮助重新植被的土地侵蚀的风险。树木和植物有助于保持土壤和防止水土流失，导致荒漠化。荒漠化是下降的，其中包括干旱，半干旱和亚湿润干旱地区的干旱地区。干旱地区近40的地球陆地约两个亿人，其中大部分生活在发展中国家。旱地土壤维持一个脆弱的生态系统，适应罕见的降水和剧烈的温度变化。过度开发旱地种植和原料用途的土壤呈现无益的，强迫迁移的社区搜索肥沃的土地，离开贫瘠的土地裸露，容易受到侵蚀力。在许多发展中国家的粮食供给缺乏强制的土地短期收益，以及砍伐森林，耕地不断培养。影响：土壤侵蚀影响的气候和生物多样性，往往会导致不可逆的荒漠化。罗茨提高土壤的稳定性和防止水土流失 。此外，树木提供掩护和保护附近的动物和植物。在容易发生水土流失的区域，这是特别重要的，因为降雨往往是罕见的，但是当它发生，它往往是非常激烈的，很容易造成表土被冲走。二：植物路线趋化性是根据吸引或排斥的化学品的细菌的运动。根系分泌多种化合物，大肠杆菌 大肠杆菌不会被吸引到自然。因此，我们设计了一种化学感受器到我们的底盘，可以感知苹果酸盐，一个共同的根渗出物中，以便它可以向根游泳。此外，E. 大肠杆菌都在积极采取了由植物的根，这将使成根，我们的系统，有针对性的IAA交付。主要由细菌运动对植物根系的植物路由模块。细菌运动的根源，微生物到自己的根。事实上，细菌，它们被用来对营养物质的植物，在植物的根，是一个新的发现，去年只当Paungfoo Lonhienne等 。非致病性大肠埃希氏菌的吸收到根的拟南芥（豆瓣）和番茄（番茄植物）。他们已经成功地复制了这些调查结果。为他们的项目，这是特别有趣的，将暴露于作为植物内的根细胞，这显着影响的细菌浓度的IAA需要产生的，以实现最佳的根生长的细菌的生长素。此外，植物路线有可能被用来作为一个平台，提供化合物，自然不会发生在工厂，没有基因改造植物本身的根。 （1）细菌趋他们的主要底盘，湿实验室的实验是大肠埃希氏菌。趋化性E. 大肠杆菌是有据可查的。这些细菌可以执行两种类型的运动，翻滚和光滑游泳。两者之间的差异被确定由鞭毛运动。在翻滚运动，鞭毛顺时针移动。这是崔泰源-P和FLIM的，一体的鞭毛相关蛋白之间的复合物的形成引起的。在平滑游泳，鞭毛逆时针移动。崔泰源未磷酸化，并因此，不能与鞭毛蛋白，导致在相反的方向旋转的鞭毛。平滑游泳是运动，进行细菌对引诱或远离剂。平滑游泳是控制趋化蛋白的信号转导通路，使一些示范。图1：大肠杆菌细胞表达superfolder GFP（sfGFP）的拟南芥根的植物与细菌培养过夜后利用共聚焦显微镜可以看到里面。根在PBS中洗涤，成像前，以避免“假阳性”的根的外侧附着的细菌。根内的细菌对于一个很酷的3D视频，看看我们的结果页。（数据和影像帝国IGEM 2011）。 （2）产品规格1。应积极迈向根的细菌。为了做到这一点，需要的细菌是能够感应到一个共同的根渗出物。我们选择了重新布线E. 大肠杆菌的趋化通路朝着L（ - ）的苹果酸（也简称为苹果酸），柠檬酸循环中发现的化合物。它是由分泌的根在低浓度。2。根吸收的细菌进入。吸收细菌进入根，接着所分泌的天然化学物质提出了一个新的平台，为修改而基因改造植物基因组的植物。3。在我们的机箱的外源基因的高效表达。由于我们是从土壤细菌的基因导入到E. 大肠杆菌我们必须考虑到影响密码子偏性，可以发挥我们的结构的表达。因此，我们必须确保我们的结构并不受这种现象的表达。（3）设计目标是确保制定的规格。1。这种细菌应该感觉到苹果酸，积极迈向根。虽然苹果酸敏感的传感器不自然地发生在E. 大肠杆菌，他们已经确定了其他一些细菌的种类，包括土壤中的微生物铜绿假单胞菌 PA01株和恶臭假单胞菌 KT2440株。PA2652是一个敏感的苹果酸的化学感受器中发现P. 铜绿微囊藻和MCP是一种受体，发现P. 恶臭响应一些TCA循环的中间体，包括苹果酸的1 2 。铜绿假单胞菌和P.趋化的分子机制 恶臭不同的大肠杆菌 大肠杆菌。然而，有高度的结构相似性的蛋白质，使在这些生物体的趋化性途径之间。因此，这是合理的假设，PA2652或MCPS域的将互动与本地的趋化途径E. 大肠杆菌，细菌将能够执行引入受体结合的趋化反应后，苹果酸盐。2。他们的底盘中的高效表达。他们用他们的密码子优化软件优化PA2652结构（BBa_K515102）表达的E. 大肠杆菌。3。构建体必须是如模块化尽可能。表达的苹果酸的化学感受器的基因结构并不复杂。然而，他们是模块化的。目前的结构，表达组成型启动子J23100受。这是的组成启动的零件注册表中最强的之一。我们选择了这个，因为它是更容易的一个结构调整的表达，而不是调整它的启动子。要表达的遗传结构调整，我们已经推出了15个基点绝缘体序列，可以方便的启动子通过PCR使用的互换性和微调的表达水平。确保启动子替换时不改变的核糖体结合位点的TIR（翻译起始速率）。PA2652和MCP翻译起始率，分别为42010和44050。4。根吸收的细菌进入。根系的吸收都E. 大肠杆菌和面包师的酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中可以观察到的模式生物拟南芥，并在番茄植株。这是一个自然发生的过程，（虽然它在土壤中，则仍有待观察），我们并不需要把额外的基因，我们的设计吸收发生。（4）模型1）简介趋化性上升趋化因子（如在我们的项目中的苹果酸）的浓度梯度和远离的驱虫剂是细菌的运动（例如毒物）。E. 大肠杆菌是太小的，检测到任何在其两个端部之间的浓度梯度。这些细菌周围的环境重新取样，每隔3-4秒，无论是翻滚导致细胞或运行。趋化因子短暂的“翻滚”（或偏见）的概率增加。这之后，由感官的适应过程，返回到基线偏置，使细胞进一步的浓度变化来检测和响应。在趋化因子浓度的变化在空间上均匀的环境中增加一小步的响应时间从1秒到2-4秒。改变的饱和水平的趋化可以增加响应时间到几分钟。每一个化学感受器上的细菌周质结合结构域和一个胞内信号结构域通信的鞭毛马达通过CHEA，崔泰源，和Chez蛋白的磷酸化继电器顺序。趋化通路建模的结果，将决定的阈值用于细菌检测的趋化因子的浓度和饱和细菌趋化检测成为在哪一级，降低细菌的趋化反应的效率。2）模型的趋化途径 2.1目的使用MATLAB模型的趋化作用的途径和8M化学感受器，从而确定检测阈值和饱和度水平的趋化因子的细菌。因为它被认为应放置在靠近最佳生长的种子（ 0），翻滚频率减小，因此翻滚的概率减小。参考中的式（10）6，我们知道，当C t1的 -C t2的 0，翻滚随着chemostatic常数，细菌速度，浓度差之间相邻的时间点和角度之间的指数函数的概率的两个时间点。8因此，我们可以凝聚上面的描述，下面的语句：3.3结果与讨论3.3.1 Baterial趋化实验室在实验室条件下，趋化因子从源头上不断扩散，因此，趋化因子随时间变化的分布格局。的误差函数（方程2）在这种情况下，被用来描述的非稳定状态下的趋化分布。对于趋化的湿实验室的实验，用户界面设计的实验方法来验证其可行性。最初，一个实验的目的是作为放置一定数量的细菌的6厘米距离与不同浓度的趋化源。放置100个细菌的趋化性的模拟的6厘米远离5 mM的苹果酸源示出在下面的电影。而这MATLAB程序具有一个图形用户界面（GUI）（图4），它可用于由湿实验室学生简单的输入参数和生成静态的图形或动画。图4： MATLAB的图形用户界面，（帝国学院2011年iGEM比赛的球队）。上面的视频显示，趋化需要14000秒扩散到菌落。在这段时间内的细菌会被复制到所有的板。因此，从建模，可以推断，这些实验结果可能无法清楚地表明趋化性（看到的结果，在我们的湿实验室）。因此，设计了新的实验设置，作为趋化因子被保持在毛细管和以及与细菌悬浮液放入;诱食扩散入井设置浓度梯度。细菌游泳的浓度梯度，给定的时间后进入毛细管，毛细管被除去，并在毛细管中的细菌数进行计数。表明在图5示出在整个实验设计。这种新的模式整合，完善我们的实验结果。这进一步细化又是通知的设计，我们的分析，这将导致更准确的数据，从而创造出精致的植物检疫路由模块之间的循环的建模和湿实验室。图5：演示实验装置的毛细管分析。（图由伦敦帝国学院2011年iGEM比赛的球队。）毛细管和趋化因子的分布状况是不同的。因此，两种趋化因子分布状况进行了推导，推导的详细信息，请在这里下载。示出的单核细胞趋化在阱的分布，在毛细管内的分布方程中所示的等式3和等式4。同样地，一个用户接口的设计，使湿实验室学生不同的输入参数（图6）。以下的视频显示的模拟与1000个细菌，用直径为1mm的填充用1mM的趋化chemotaxing朝向毛细管。图。图7示出了在每个时间点在毛细管中的细菌数量。该模型表明，在毛细管中积累的细菌，是在3600秒的最大数目。因此，我们的模型表明，的湿实验室的学生应执行本实验为60分钟，然后收集数据。图6： Matlab的图形用户界面，为我们的趋化毛细管分析。（帝国学院2011年iGEM比赛的球队）。图7：细菌的数量在毛细管与时间（帝国学院2011年iGEM比赛的球队）。3.3.2在土壤中的细菌趋在现实的土壤，苹果酸盐用作趋化。马拉特是不断从根尖分泌3 mM的9的浓度。在这种情况下，苹果酸源总是补充由于持续分泌从根和分配方式可以被认为是稳定的（即与时间无关）。的稳定状态Keler的谢格尔模型是用来证明这个分布（公式5）。真正的苹果酸在土壤中的分布显示在图5。细菌趋药性的路径，当将细菌在稳态苹果酸分布在不同的位置上时，表明在图5。图8（a）：的苹果酸盐的距离（1D），图8（b）：苹果酸盐用半径（2D）中的分布的分布，图8（b）示出的位置的阈值检测的浓度（1e的-8 M的半径= 0.028 m）和饱和浓度（是1e-5 M的半径= 0.012）。图9：与细菌的趋化性放置在不同的起始位置。 蓝：210 5秒趋化开始于半径= 0.015米（之间0.012 m和0.028米的），绿色：210 5秒趋化开始于半径=0.008米，这是小于0.012。这表明的细菌的趋化反应是低效的，当它们被放置在从根尖端0.0028米0.0012米。绿线表示，这种细菌可保持接近的种子，当它被放置在远离根尖的距离小于0.012米。因此，该模型表明，这种细菌被放置在一个距离小于0.012米，在我们的项目实施。最后，用于细菌检测的阈值的趋化因子的浓度是110 -8 M和细菌趋化检测变得饱和水平是110 -5 M。我们还表明，检测阈值和饱和度水平是趋化因子受体的数量无关，然而，为了使最大灵敏度，最强的启动子应该选择植物路由模块。此外，与苹果酸浓度等于3 mM的，阈值检测的浓度是在从根0.028米的距离，和饱和浓度达到0.012米（1.2厘米）远离根。从建模的细菌种群的趋化性，我们观察到根的趋化性是缓慢的，如果该细菌最初放置在两者之间0.012 m和0.028米的，同时，放置从根0.012米内细菌时，细菌很可能稳定和保持密切的根。稳定的细菌本地化，（1.2厘米）的距离是大于0.25厘米（营养物质可以有效地根的距离），因此，建议的细菌，我们的种皮的实施，应放置在或接近0.25厘米远离根。二：生长素（1） 概观生长素，或吲哚-3 -乙酸（IAA），是一种植物生长的激素，它是通过几个土壤细菌。我们已经采取的基因编码，从假单胞菌savastanoi IAA生产的途径，并表示他们在大肠埃希氏菌。植物路由模块对根和吸收趋化之后，IAA表达，目的是提高土壤的稳定性，促进根系生长其也被称为是一个充分研究的负责响应于生物和非生物胁迫的用于植物生长的植物激素。通常，类似的-萘乙酸（NAA）和2,4 - 二氯苯氧乙酸（2,4-D）的合成生长素作为除草剂的使用。在过去的50年来，由于他们的高效率和廉价的成本，他们已经在作为除草剂的用途。虽然生长素是一种促生长的激素，它可以在高浓度下对植物的代谢负担，因此，毒性。合成生长素是非常稳定，在土壤中能坚持几个星期，这就是为什么他们是非常有效的除草剂。IAA，在另一方面，是化学不稳定的，并可以很容易地由植物代谢。因此，如果我们在我们的底盘生产IAA，它应该促进而不是阻碍植物根系的生长。仍然是一种风险，即IAA可以仿照在硅片告知生长素随心模块的设计，其合成前在高浓度，因此，基因表达水平的植物是有毒的。我们的目标是产生IAA E. 大肠杆菌中以受控的方式，以便它永远不会到达的毒性阈值。在整个项目，该模块将负责影响根系生长，形成复杂的根网络，可以有效地保持土壤，防止其侵蚀的目的。图1。的化学结构，合成的和天然的生长素。（图片由先正达提供）。（2）产品规格1。一个简单的的IAA生产的途径，可以表现在我们的底盘。IAA是一种植物激素，促进植物生长的细菌快递（PGP） IAA的植物对营养物质的交换。有几种不同的途径可以制作IAA（图1）。我们决定使用的IAM的途径，因为它已被证明在E.工作 大肠杆菌，并且由的只有两种酶。2。片段序列设计适合聚合酶延伸组件的方法，以最低的成本。我们决定用聚合酶延伸，而不是标准限制连接的组件的装配，因为它将使我们能够订购多个片段的序列。这将保持低于1000 bp的订单，也降低了生产时间。此外，像吉布森和CPEC的方法，使我们能够建立包含多个组件的结构，在一个反应，而不是不必结扎每个BioBrick顺序的。3。实现足够的IAA的表达水平在我们的底盘，在我们的工厂模式，以提高根系的生长。IAA在我们的底盘表达的目的是提高植物根系的生长，并最终提高土壤的稳定性。因此，我们需要的IAA浓度的影响根系生长模拟和测试，以确定最佳的浓度不引起毒性。4。调整的IAA生产水平启动子不影响RBS强度的情况下切换。要促进未来调整的表达，我们在设计结构时，苏格兰皇家银行是不会受到影响的发起人。为了做到这一点，我们增加了15个基点绝缘体它们之间的序列。5。建立一个结构，密码子优化为E. 大肠杆菌和B。枯草芽孢杆菌。我们使用的是E. 大肠杆菌作为我们的机箱，因为人类实践问题，周围环境中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的蔓延。此外，它已被证明，大肠杆菌 大肠杆菌是采取了积极的拟南芥 2 。然而，在未来，我们希望有可能建立相同的构造B. 枯草芽孢杆菌，一个突出的土壤中的孢子形成的细菌。图1。有几种不同的IAA的生产途径。该IAM通路是一个两步骤的途径，从前驱体色氨酸生成吲哚-3 -乙酸（IAA）。IAA色氨酸单加氧酶（IAAM），催化氧化羧化的L-色氨酸为吲哚-3 -乙酰胺水解为吲哚-3 -乙酸和氨的吲哚乙酰胺水解酶（IAAH）1 。（3）设计他们心中的规格，我们通过文献搜索和咨询专家告知我们的IAA表达结构的设计。1。该IAM通路是一个简单的IAA的制造途径与只有一个中间。他们选择，使用IAM（吲哚乙酰胺）的途径，来源于假单胞菌savastanoi。此途径只涉及两种酶产生IAA（iaaM和战胜饥饿国际联盟），因此最大限度地减少碎片的数量，我们需要在我们的结构组装。2。设计适合于基于聚合酶延伸组装的基因序列。由于他们有两个比较大的酶（约61 kDa和47 kDa的），他们决定每一个分裂成两个片段，以加快其合成。他们设计了50 bp的重叠区域的端部的每一个的四个片段，以便能够快速基于聚合酶延伸的组装成标准pSB1C3矢量。3。实现足够的IAA的表达水平在我们的底盘，以提高我们的模式植物的根系生长。我们将iaaM和战胜饥饿国际联盟基因的控制下的Pveg2启动。我们选择该启动子，因为它是功能E. 大肠杆菌和B。枯草芽孢杆菌。4。是绝缘体序列设计，使启动开关。为了使调整的IAA生产，使用不同强度的推动者，我们正在设计一个绝缘体序列前面iaaM和战胜饥饿国际联盟，不影响RBS实力的情况下启动开关，以方便使用PCR的核糖体结合位点。5。联合密码子优化E. 大肠杆菌和B。枯草芽孢杆菌他们做了一个密码子优化软件，优化两款机箱都提供灵活性，在未来的iaaM和战胜饥饿国际联盟序列，尽管我们目前使用的E. 大肠杆菌作为我们的底盘。（4）模型1）简介足够的生产能有效地促进植物根系生长的植物激素或转基因（GM）大肠埃希氏菌吲哚-3 -乙酸（IAA） 。但是，IAA是对植物有毒的，如果它的浓度过高。因此，重要的是IAA表达水平能够预测一个给定的子，然后调整子强度，以保证我们的大肠杆菌最佳的IAA 增加根系生长。IAA增加根系生长，根长和分支数量方面。为了研究不同浓度的IAA影响根系的生长模式，建模工具，用湿实验室检测结果，结合预测和可视化拟南芥根系生长。2）IAA合成模拟 2.1目的一个单一的E.确定IAA表达水平 大肠杆菌细胞与IAA启动子强度4.536 RNA /分钟/g的底物DNA，然后预测要放置在种子涂层，诱导最佳的根生长的细菌数量。2.2说明遗传工程的IAA途径涉及两个基因，iaaM和IAAH，这两者都是组成型表达。IAAM基因编码色氨酸2 -单加氧酶（T-2-monase），色氨酸（Trp）的吲哚-3 -乙酰胺的催化转换（IAM），然后将其水解以释放吲哚-3 -乙酸（IAA）由水解酶IAAH 3 。在同一时间，合成的IAM和IAA将竞争性地抑制色氨酸2 -单加氧酶的酶活性，从 而诱导的IAA的表达上的负反馈环路。图1中示出在该途径所涉及的酶促反应。图1：IAA合成途径。（图由伦敦帝国学院的iGEM比赛的队）。此外，从美国科罗拉多大学的研究进行了数学生物学研究组的基础上4 ，色氨酸也是负面的控制内的细菌。因此，色氨酸合成途径应纳入上述模型。此外，为了减少的数目的参数，如在图1中的参数大多数是不提供给我们，在IAA通路然后分为两个米氏米氏方程，与色氨酸的途径和组成型基因表达的T相结合的简化-2-monase和IAAH。整个色氨酸IAA通路模型5中描述的公式1 ，和参数定义在下面的参数部分。在这个模型中，我们提出以下假设：（1）他们忽视了很短的时间延迟，由于TRP-T-2-monase（底物酶（ES）复杂的），IAM-战胜饥饿国际联盟（ES的复杂），IAM-T-2-monase（抑制酶的合成（ EI）配合物）和IAA-T-2-monase（抑制剂的酶（EI）络合物），并假定这些物种几乎在瞬间达到其平衡。（2）IAA的降解率在黑暗中细菌的生长速度相比是非常低的。因此，我们使用了细菌的生长速率，在这个模型中的IAA降解率。在建模的IAA通路（3），我们发现，IAA合成的速率确定的物种是（IAM），而不是酶IAAH，因为生产的IAM被抑制本身和IAA。2.3结果与讨论1。每个蛋白物种的浓度是如何随时间变化。2。各物种的酶促反应，与O F = 1.5410 -4 M，M F = 3.7810 -4 M，E = 0.378M，色氨酸= 4.1M和所有其他= 0的初始浓度的模拟4。此外，图2示出，IAA的表达水平为72.35M，这意味着每个细菌生产的7.2410 -14微摩尔每细菌在稳定状态下与细菌的体积等于10 -15分米3。从潮湿的实验室实验中，我们知道，IAA以促进根系生长的最佳浓度为0.1 nm，和拟南芥种子的体积约等于3.610 -9米3 7 。因此，需要存在于种皮，以最大限度地提高根根系生长的细菌数为4.9710 6。详细的计算中列出如下：1。一个单一的细菌所产生的摩尔数是72.35微米* 10 -18米3（7.235 * 10 -17微摩尔）。2。的IAA的摩尔数，需要在一个种皮是3.6 * 10 -9米3 * 0.1 nmol。3。细菌的数量需要是发生在一个种皮（3.6 * 10 -10微摩尔）/（7.23510 -17）= 4.9710 6。 图2（a）：（的IAM）随时间的演变。图2（b）：的IAA对时间的演变。总之，我们获得的IAA浓度的，IAA DNA结构（72.25M）产生的。从这个值，我们计算出的细菌数量，将需要输入理想的生长条件，而忽略死亡和分裂的细菌，这被认为是4.97x10 6 细菌拟南芥的根目录下。此值由于在不同的植物种子大小的变化而变化。由于细菌细胞可从该植物中丢失，不是所有的细菌从种皮进入工厂，在种皮所需的细菌的数目将是高于此。此外，在接下来的部分根系生长模型帮助我们想象的根系生长。3）IAA的吸收和根系的生长3.1目标1创建一个图形程序来演示的拟南芥根系的生长过程，Lindenmayer系统和植物生理学的原则的基础上。2使用Matlab数据拟合工具来开发IAA浓度和增长速度的分行数目之间的关系。3.2说明我们使用计算的工具，visulise根系生长的现象，（主要根长，分枝，根系密度等）在不同的enviromental条件下，特别是根序和根长。根为了描述一个根系统的分支“代”，被定义为一个零阶根的根不分枝。根系生长取决于环境因素的影响，比如引力和土壤的非均质性。3.2.1向性一个根系统启动的零阶根单根的尖端。然后根远离植物的茎生长在一个锥形的方式10 。根系生长取决于环境因素的影响，比如引力和土壤的非均质性。因此，两个更多的变量被定义为描述植物适应- 多么强大的根每平方厘米的增长方向的变化- 一个更大的值表示更偏转的根和更扭曲的根系统- 试验的次数，其根部，以找到最佳的角度和的旋转的向下运动- N可以是任意实数。如果N = 1.5，如果，N可以是1或2的装置。图3：不同的N值和的根系统之间的差异。（建模根据丹尼尔莱特纳等人BOKU和代码的修改，由伦敦帝国学院2011年iGEM比赛的球队）。3.2.2 Lindenmayer系统和根系的生长模型L-系统是一个平行的重写系统，即一个正式的语法的一个变体，最有名的用于模拟植物发育过程中的生长，但也能够模拟各种生物体的形态，由于两个主要性能：递归和自相似性11 。植物模型和自然的有机形态很容易定义，如通过增加递归级别的形式慢慢“长大”，并变得更加复杂。使用L-系统，用于产生图形图像的要求，在模型中的符号是指在计算机屏幕上的图的元素。解释每不变的L-系统模型的龟命令。 3.2.3根系生长;造型的IAA摄取的预测答案的问题，如：“什么是初生根的生长率是多少？”“什么是根系统一段时间后的样子吗？”“如何拟南芥不同IAA浓度？“ 我们修改一个MATLAB程序开发丹尼尔莱特纳的研究小组6展示的3D根系统的基础上的原则林登梅耶系统（龟的命令），并在根增长模型工具箱由丹尼尔莱特纳等人从BOKU（Universitt献给Bodenkultur维也纳开发维也纳的自然资源和生命科学大学）12 。 3.2.4数据拟合我们采取了从文献的增长速度参数，我们的湿实验室的原始数据，为我们的项目提供更准确，更合适的参数进行了分析。拟南芥植物种植和根的长度和数量的分支记录每两天从第0天到第9天。根长，每天根系生长速率和分支数量绘制了时间和IAA浓度。 3.3结果与讨论3.3.1根系统的可视化从文献中的值给外部IAA浓度之间的关系，和根的伸长为510 -5 mol / L的200m的伸长率在30分钟内。因此，生长速度的建模参数是9.6 * 10 -3 m /天。我们观察到真正的根的生长模式和修改我们的模拟，以提供更可靠，更准确的预测根的生长。拟南芥中有一个主根与零阶和它厚比分行。拟南芥一般长到20-30厘米的深度内的土壤和分支只有一次。如下所示的3D画面预测的根的生长具有不同伸长率（与IAA = 0.96厘米/天;未经IAA = 0.46厘米/天10 ）。它们可与一个真正的根系统的照片。 图4：拟南芥根系统的3D visalisation。的曲线图图4（a）（b）表示不同IAA浓度作为我们的模拟结果中的生长时间为20天的条件下与的拟南芥根系统中示范。图4（c）（d）是真正的拟南芥植物的文献和我们的湿实验室的实际照片。（建模根据丹尼尔莱特纳等人BOKU和代码的修改，由伦敦帝国学院2011年iGEM比赛的球队）。（4）装配图。1：大会战略为我们的生长素随心结构。（图由伦敦帝国学院2011年iGEM比赛的球队）。我们下令iaaM和IAAH作为两个片段的编码序列，以减少成本和时间（片段1，2，3和4）。我们不希望使用PCR扩增的片段，以避免引入到我们的最终构建的突变，因此我们将我们的MlyI限制性内切酶的合成序列两侧的钝的一端切点。说穿了，Mly1（II型限制性内切酶）削减5个碱基的识别位点距离。此属性允许我们只切出各片段的编码序列。每一个消化的片段，然后凝胶提取准备组装。pSB1C3载体的骨架载体的同时反PCRd放大所需的重叠。我们计划相结合的四个片段到pSB1C3载体由吉布森装配，不幸的是，我们的尝试都失败了，我们推测，这是由于骨架载体上的同源性，使其重新退火。我们恢复到CPEC组装结构，一种方法，需要更广泛地使用PCR比吉布森。这就是说，通过引入MlyI的酶切位点，我们的人数减少一半所需要的PCR步骤，从而减少了潜在的突变率。循环聚合酶延伸克隆（CPEC）是一个独立的引物PCR装配技术，它依赖于各部分之间的重叠序列进行组装。有了一个变性步骤中，双链DNA的熔融，允许兼容的单链的两端各部分加入。出于这个原因，它是必不可少的，该部件被设计为同源的端部（被设计我们所使用的片段用50 bp的重叠）。退火后的重叠端，然后作为引物，聚合酶延伸的部分加入到一个无缝的构造。CPEC的第一次尝试是成功的。DNA由E. 大肠杆菌 DH5中菌落的组装构造转化miniprepped并发送到欧陆用于测序。序列进行了验证，所以我们进行特征IAA生产建设。图。2：组装结构限制切割骨干前缀和后缀分别用EcoRI和PstI消化，使我们能够确定如果插入是正确的大小。1巷包含1 KB +梯作为参考。泳道2，泳道3 PstI和第4泳道都用EcoRI消化。将得到的带的大小是约4 kb的与组装的四个片段的大小。（数据由伦敦帝国学院2011年iGEM比赛的球队）。图。3：甲最终生长素随心构造示意图。点击每个部分被定向到零件注册表的相关页面。（图由伦敦帝国学院2011年iGEM比赛的球队）。三：基因卫士遏制是一个严重的问题，关于释放到环境中的转基因生物（转基因生物）。为了防止基因水平转移的基因表达我们的底盘，我们已经开发出一种系统的基础上，编码holin，反holin和溶素的基因。我们是工程的抗holin到我们的底盘，在那里它的作用作为抗毒素，和holin和细胞内溶素的质粒DNA上的基因组中。在与土壤细菌的水平基因转移事件，holin和细胞内溶素将不含抗holin转移，使受体细胞非可行的和有效含有生长素Xpress和植物路线基因在我们的机箱的。（1）概观对于人类实践告诉我们项目的设计，我们决定拿出新的解决方案，以转基因生物的环境释放的风险降到最低。我们试图想超越遏制“杀死开关”机制，并提出了这样的问题：“什么最坏的情况下，如果我们要释放我们到野外的转基因？“ 和“如何避免这些问题呢？”。转基因生物释放的最棘手的后果之一是水平基因转移的非天然质粒DNA，以现有的土壤细菌，经常发生的过程。基因Guard是一种新的机制，以防止转基因生物的遗传物质的交流，以防止自然发生的微生物基因的水平转移，因此一个可行的解决方案。它将使用一个毒素/抗毒素系统，其中反holin被整合到基因组中，我们的机箱中，将防止holin上的质粒编码的内溶素，以裂解细胞。然而，如果该质粒被转移到任何其他细菌的物种，是不是我们改造细菌，它会引起细胞裂解，从而防止包含在我们的GMO的遗传信息的传播。该模块的组装和测试的同时，我们尝试与土壤中的细菌，看到多久，他们保留了GFP表达E.获得的荧光 通过水平基因转移的大肠杆菌。对于我们人类实践的方法对转基因释放的更多信息（2）产品规格1。防止任何其他细胞，是不是我们自己的GMO非可行的水平基因转移水平基因转移（图1）是主要的问题，我们能想到的，当它来释放转基因生物在现场测试，后来在项目的实施阶段。这是一个共同的问题，即使在转基因作物，转基因生物和自然生物之间的异花授粉是恒定的忧虑。在细菌中，基因通常转移到其他物种通过共轭或通过从溶解的转基因生物的遗传物质的摄取。由于遗传物质仍然可以采取其他物种的裂解后我们的转基因生物，其中一个使用一个输入诱导裂解是一个传统的杀开关不是一个可行的和安全的选项。因此，我们认为，设备必须是内的遗传物质本身，而不是自然产生的细菌引起的反应。展望杀死在过去已经使用的开关，我们发现的T4 holin-溶素系统。如果我们要添加这些基因的质粒，我们可能引起的任何有机体，我们已经采取了质粒的直接裂解。 图1。水平基因转移（格雷斯金，2006年1 ）2。该模块必须不受到伤害的我们自己的转基因T4噬菌体必须能够延缓其主机之前，它是可以复制和装配的许多副本本身的裂解。为了做到这一点也有T4噬菌体的蛋白质称为抗holin结合从而防止细胞裂解的holin。本质上，该系统的工作原理作为定时器给噬菌体足够的时间来复制。通过使用反holin的从这个系统中，我们可以防止我们自己的细胞裂解。然而，我们不能有它的质粒否则仍可能有两个质粒的有机体的可能性。因此，我们必须锚定的基因组内。为了做到这一点，我们需要用CRIM质粒。CRIM（复制的条件，整合和模块化）质粒可以集成在单一的副本到基因组的E. 大肠杆菌。3。表达的设备不会有太大的代谢负担由于我们的最终系统将使用植物路线和生长素随心模块的，我们必须考虑，修改后的细菌就已经是下一个巨大的代谢负担。因此，使用必要的最低限度的资源基因警卫促进趋化对苹果酸和IAA生产由我们的系统将是有益的。4。必须能够来测试系统是否要做到这一点，我们必须使用报告基因。最常见的报告基因的荧光蛋白RFP和GFP等。由于质粒CRIM，已经有sfGFP，我们将使用，测试表达反holin。为了测试是否该质粒是功能，我们将结合RFP到质粒。我们希望能够看到一个天然的细菌质粒荧光红色宽视场显微镜前裂解。（3）设计目标是确保制定的规格，被认为是基因卫队的设计。1。防止任何其他细胞，是不是我们自己的GMO非可行的水平基因转移T4细胞内溶素和T4 holin的是反PCRd从BBa_K112808。然而，我们必须确保接收这些基因的细胞裂解。为了确定所使用的启动，我们模拟整个系统。既然有这么多的holin和溶素（高拷贝质粒）等少数几个副本的holin基因（基因组）的副本，我们决定J23103子相对于J23100子，我们可以选择正确的强度。但是，我们也有这个弱的启动子型号是否有足够的接收质粒的细胞裂解。根据我们的模型，任何接收我们的holin的和溶素基因的细胞裂解。2。该模块必须不受到伤害的我们自己的转基因此模块主要依赖于模型在设计过程中。我们必须考虑到一个事实，即质粒的拷贝数和基因组中的拷贝数是可变的设计时，毒素和抗毒素成分。我们发现，该启动子的holin-细胞内溶素的质粒具有弱于的holin构建体中的基因组是有效的是40-400倍。该比率应采取考虑到的基因的拷贝数之间的可变性，并确保不存在的至少一个为每一个反holin分子产生holin分子。可以肯定的是，我们修改后的细菌会存活holin的和溶素的生产，我们选择了J23103的启动子具有一定的实力在低端的启动子强度范围。这提供了以下两种结构的设计：3。表达的设备不会有太大的代谢负担虽然这个规范是非常重要的，它没有在这个版本的模块的设计中发挥了巨大的作用。这是因为，就目前而言，生长素是一种概念证明系统。一旦它已经表明，基因Guard是一个可行的遏制方法，我们将修改的构造，以实现具有抗holin灭活holin，而不是对细胞是一个很大的负担之间的理想平衡。4。能够测试系统的工作原理为了做到这一点，我们决定附加RFP作为holin根据相同的启动子和细胞内溶素的基因的编码序列。这将使我们能够轻松，直观的测试细胞是否包含我们的质粒。至于holin构建体，CRIM质粒已经包含一个sfGFP的序列。将能够区分我们完成的构建从每一个其他的细胞，由于其卡那霉素和氨苄青霉素抗性，以及其生产的RFP和sfGFP。因此，我们将能够看到我们的质粒转移到一个单元格不发出绿色荧光，应该是能够跟踪是否溶解或下宽视场显微镜。（4）模型1）简介基因防护装置包括三种蛋白质：1。 Holin是一种蛋白质，形成孔隙的配合物在细菌内膜和这些孔允许细胞内溶素进入的周质空间。2 溶素是一种酶，能分解细胞壁和诱导细胞裂解。3。 反holin结合holin并阻止它的形成毛孔。我们的系统将holin和细胞内溶素的基因一起的草本-路由和生长素随心基因的质粒上，和反holin基因的强启动子的控制下的基因组上。该生产的抗holin的会阻止细胞裂解的转基因（GM）细菌通过停用holin。如果该质粒不含抗holin它的基因组（例如任何野生型土壤细菌）转移到一个不同的细菌，holin和细胞内溶素的表达诱导细胞裂解。这将防止扩散的生长素载体，含有植物的路线和生长素随心基因，自然产生的土壤细菌。2）目标此设备的成功的关键是正确的比例，这样的反holin的，可以关闭所有holin，我们修改后的细菌中产生的，并holin的表达水平野生型细菌的holin和反holin的生产是高到足以诱导细胞溶解。控制基因表达的启动子强度和核糖体结合位点（RBS）的实力，造型的基因警卫，重要的是要帮助我们选择适当强度的一个子和苏格兰皇家银行的。3）说明基因卫兵的建模由两部分组成，一个是在野生型细菌的holin生产和其他抗holin holin的失活在我们的改性的细菌。因为在我们的系统中的所有的基因组成型表达，我们只考虑稳定状态。在野生型土壤细菌的Holin生产导出一个单一的质粒的启动子强度之间的关系，和RBS强度holin集中在这部分的造型。为了模拟这种情况，作如下假设：1）基因卫队包含在一个pSB1C3质粒含有pUC19中衍生的促进pMB1复制起点（100-300分子每单元）5 。在细菌中的质粒的数量范围从100到300每个细胞。为了确保子和苏格兰皇家银行是足够强大的的holin /溶素是有效的，我们低估了质粒的土壤细菌为50，尽管他们总是至少有100。因此，我们的系统时，应该工作的质粒在土壤细菌的数目是大于50。2）该文献表明，发生细胞溶解在holin等于1000个分子/细胞的浓度1，5，6 ，因此，我们用这样的细胞裂解在我们的系统中的阈值浓度。3）由于所使用的结构表征Pveg子去年包含一个突变中，我们假设， 我们用于抗holin的启动，Pveg2具有相同的强度，Pveg。基于这些假设，野生型细菌细胞裂解的动力学模型，用普通的微分方程（ODEs）的holin表达和holin的蛋白质（公式1）。在稳定状态（即 表达holin / DT = 0和d holin / DT = 0），重新整理式（1）holin = 1000，我们获得了表达在所示为P holin K表holin的公式2。Holin抑制基因细菌在我们的细菌的基因组上的强度的启动子和RBS控制表达的反holin应该高于与holin一个单一的质粒，例如，300的质粒的拷贝（最大拷贝数在一个单一的细菌所产生的所有的holin ）可以被抑制。在我们的系统中，抗-holin到holin结合形成二聚体，它被定义为失活的holin。由式（3）的机制，我们修改后的细菌。我们定义的启动子和RBS强度的比率分别为抗-holin和holin为“m”，如公式4中看到。4）结果与讨论 通过改变比m的公式4中，我们发现，在转基因细菌holin浓度下降至零比米300（参见图1）。然后，我们测试了米= 400与反holin启动子（J23100），我们有与强度13.1皮克核糖核酸/分钟/g的底物DNA，其结果是显 示在图2中。图1：在转基因细菌holin浓度与比m（米=（P 的抗holin 抗holin）/（P holin holin）。本图显示了细胞内的浓度holin保持在零，如果m 300。（模型由英国伦敦帝国学院2011年iGEM比赛的球队）。图2：在m = 400的不同蛋白物种随时间的演变。所有的holin蛋白在转基因细胞的抑制的holin浓度保持在所有的时间，而holin野生型细菌的浓度达到1000每单元后5000秒的模型由伦敦帝国学院2011年iGEM比赛的球队。总之，基因后卫的造型告诉他们，启动子的强度和RBS holin和反holin的强度可任意选择，只要他们的比率（即 P的反holin K表抗holin）/（holin K表holin的） 300），以使其一定，的比例值400被选择为我们的项目。