生化检验基本知识-2

第二章第二章第二章 生化检验实验室基本知识生化检验实验室基本知识生化检验实验室基本知识-2-2 -2第三节第三节 检测系统的选择与评价检测系统的选择与评价第四节第四节 试剂盒的选择和评价试剂盒的选择和评价检测系统的概念？检测系统的概念？实验方法选择的目的、原则和内容实验方法选择的目的、原则和内容何谓决定性方法？参考方法？常规方法？何谓决定性方法？参考方法？常规方法？推荐方法？推荐方法？各级实验方法与标准试剂应用的关系？各级实验方法与标准试剂应用的关系？系统误差和偶然误差的定义、特点和主要原因各种方法评价指标及其评价方法有哪些？各种方法评价指标及其评价方法有哪些？思考题：思考题：完成一个项目的测定所涉及的仪器、试完成一个项目的测定所涉及的仪器、试剂、校准品、质控品、消耗品、操作程序、剂、校准品、质控品、消耗品、操作程序、质量控制程序等的组合。质量控制程序等的组合。 实验方法的实验方法的选择选择是生化检验是生化检验质控质控的基础，的基础，而方法学而方法学评价评价是方法是方法选择选择的依据，由此可见，的依据，由此可见，方法的选择与评价是全面质控工作中必不可方法的选择与评价是全面质控工作中必不可少的重要环节。少的重要环节。 选择选择准确可靠准确可靠的实验方法的实验方法为为临床临床提供提供准确可靠准确可靠的信息的信息临床生化检验分析临床生化检验分析u实验方法选择的目的实验方法选择的目的u实验方法的分级实验方法的分级 u标准试剂的分级标准试剂的分级保保证证一、实验方法的选择一、实验方法的选择 目的？目的？选择精密度和准确度符合临床要求，选择精密度和准确度符合临床要求，快速，操作简便，成本低的检测手段。快速，操作简便，成本低的检测手段。（一）实验方法选择的目的和原则（一）实验方法选择的目的和原则 原则原则? 1. 1. 实用性实用性 包括微量快速，便于急诊、费用包括微量快速，便于急诊、费用低廉、应用安全。低廉、应用安全。 2. 2. 可靠性可靠性 有较高的精密度、准确度和较大有较高的精密度、准确度和较大的检测能力。的检测能力。（二）实验方法的分级（二）实验方法的分级分级依据分级依据： IFCC IFCC根据分析方法的根据分析方法的准确性与精密度准确性与精密度的不同。的不同。v决定性方法决定性方法 v参考方法参考方法 v常规方法常规方法 分为三级：分为三级：IFCCIFCC：国际临床化学联合会：国际临床化学联合会71 1、决定性方法、决定性方法 definitive methoddefinitive methodp定义：定义： 是指是指准确度最高，系统误差最小准确度最高，系统误差最小，经，经过详细的研究，过详细的研究，没有发现产生误差的原因或在某没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法些方面不够明确的方法，其测定结果与真值最为，其测定结果与真值最为接近。接近。p主要方法：主要方法：重量分析法、重量分析法、中子活化法、同位中子活化法、同位素稀释素稀释- -质谱分析法（质谱分析法（ID-MSID-MS）p应用：应用： 由于由于技术要求太高，费用昂贵技术要求太高，费用昂贵，只用于，只用于评价评价参考方法与一级标准品参考方法与一级标准品。这类方法不直接用于鉴定常规。这类方法不直接用于鉴定常规方法的准确性，方法的准确性，82 2、参考方法、参考方法 reference methodp定义：定义： 是指是指准确度与精密度已经被充分证实准确度与精密度已经被充分证实，且经，且经公认的权威机构（国家主管部门、相关学术团体和国际公认的权威机构（国家主管部门、相关学术团体和国际性组织等）颁布的方法。性组织等）颁布的方法。 这类方法这类方法干扰因素少干扰因素少，系统误差很小，有适当的灵系统误差很小，有适当的灵敏度、特异度、较宽的分析范围并且线性良好敏度、特异度、较宽的分析范围并且线性良好，重复测，重复测定中的定中的随机误差可以忽略不计随机误差可以忽略不计。p主要方法：主要方法：原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法、火焰光度法、免疫、火焰光度法、免疫化学法，离子交换层析法等化学法，离子交换层析法等 p应用：应用： 能在能在条件优越条件优越的实验室作的实验室作常规分析常规分析，主要用于主要用于评价常规方法；鉴定二级标准品和为质控血清定值；用评价常规方法；鉴定二级标准品和为质控血清定值；用于商品试剂盒的质量评价。于商品试剂盒的质量评价。93 3、常规方法（、常规方法（routine method ）p定义：定义： 应具有应具有足够的精密度、准确度和特异度，有适足够的精密度、准确度和特异度，有适当的分析范围，经济实用当的分析范围，经济实用，其性能指标符合临床或其它目，其性能指标符合临床或其它目的的需要。的的需要。p主要方法：主要方法： 分光光度法、离子选择电极分光光度法、离子选择电极法等。法等。p应用应用： 临床临床常规检验常规检验使用，常使用，常规方法在作出评定以后，经规方法在作出评定以后，经有关学术组织认可，可以作有关学术组织认可，可以作为为推荐方法（推荐方法（recommended recommended methodmethod ） 。10项目项目决定性方法决定性方法参考方法参考方法钙钙ID-MS原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法氯氯电量滴定法、中子活化法电量滴定法、中子活化法电流滴定法电流滴定法镁镁ID-MS原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法磷磷ID-MS钾钾ID-MS、中子活化法中子活化法火焰光度法火焰光度法钠钠重量分析法、中子活化法重量分析法、中子活化法火焰光度法火焰光度法白蛋白白蛋白免疫化学法免疫化学法总蛋白总蛋白双缩脲法双缩脲法肌酐肌酐ID-MS、离子交换层析离子交换层析法法离子交换层析法离子交换层析法尿素尿素ID-MS尿素酶法尿素酶法尿酸尿酸ID-MS尿酸酶法（紫外法尿酸酶法（紫外法）胆红素胆红素重氮反应法重氮反应法葡萄糖葡萄糖ID-MS己糖激酶法己糖激酶法胆固醇胆固醇ID-MSAbell-Kendall法，法，胆固醇氧化酶法胆固醇氧化酶法甘油三酯甘油三酯ID-MS酶法酶法AST（GOT ） MDH-NADH法法ALT（GPT）LDH-NADH法法转肽酶（转肽酶（r-GT）连续监测产物生成法连续监测产物生成法肌酸激酶肌酸激酶 NAD+偶联法偶联法11（三）标准试剂的分级（三）标准试剂的分级标准试剂（标准品）的定义：标准试剂（标准品）的定义： 国际标准化委员会将标准品（参考物，国际标准化委员会将标准品（参考物， reference material）的定义暂定为：）的定义暂定为： 它的它的一种或几种物理或化学性质已经充分确定一种或几种物理或化学性质已经充分确定；被用于；被用于校正仪器或用于评价一种测定方法校正仪器或用于评价一种测定方法的物质，并将其分成三级。的物质，并将其分成三级。标准品的应用：标准品的应用：方法评价、仪器校正、常规分析的质量控制方法评价、仪器校正、常规分析的质量控制标准品的分级：标准品的分级：v一级标准品一级标准品 v二级标准品二级标准品 v控制物控制物 121 1、一级标准品（原级参考物）、一级标准品（原级参考物）p定义：定义： 是是已经确定的稳定而均一已经确定的稳定而均一的物质，其数值已由决定的物质，其数值已由决定性方法确定或由高度准确的若干方法确定，性方法确定或由高度准确的若干方法确定，所含杂质已所含杂质已经定量经定量。p应用：应用： 用于用于校正决定性方法，评价和校正参考方法以及为校正决定性方法，评价和校正参考方法以及为“二二级标准品级标准品”定值。定值。132 2、二级标准品（次级参考物）、二级标准品（次级参考物）p定义：定义： 这类标准品可以是这类标准品可以是纯溶液纯溶液（水或有机溶剂的溶液），（水或有机溶剂的溶液），也可以也可以存在于相似基质中存在于相似基质中。可由实验室自己配制或为商。可由实验室自己配制或为商品，其中有关物质的量由参考方法定值或用一级标准品品，其中有关物质的量由参考方法定值或用一级标准品比较而确定。比较而确定。p应用：应用： 主要主要用于常规方法的评价和控制物的定值。用于常规方法的评价和控制物的定值。143 3、控制物（质控物）、控制物（质控物） 用二级标准品和常规方法测定，用于常规质用二级标准品和常规方法测定，用于常规质量控制，以控制病人标本的测定误差。控制物不能量控制，以控制病人标本的测定误差。控制物不能用于标定仪器或方法。用于标定仪器或方法。 定值血清：在发生问题时查找原因定值血清：在发生问题时查找原因 未定值血清：一般情况下使用未定值血清：一般情况下使用校准品：校准品： 用二级标准品和常用二级标准品和常规方法定值，经过修正规方法定值，经过修正后的后的质控物质控物。决定性方法 一级标准品参考方法 二级标准品常规方法 控制物各级实验方法与标准试剂应用的关系各级实验方法与标准试剂应用的关系 1、选择方法需考虑下列三个方面内容、选择方法需考虑下列三个方面内容 方法学特性方法学特性 包括化学反应原理、最适反应条件、包括化学反应原理、最适反应条件、标化方法及分析操作的严密性等。标化方法及分析操作的严密性等。 工作特性工作特性 包括分析测定范围（线性或工作范围）、包括分析测定范围（线性或工作范围）、精密度、回收率、干扰、准确度及检出限度等。精密度、回收率、干扰、准确度及检出限度等。 应用特性应用特性 包括实用性、成本费用、标本来源与种包括实用性、成本费用、标本来源与种类、样品用量、分析速度，对设备条件与操作技术要类、样品用量、分析速度，对设备条件与操作技术要求，方法的安全性。求，方法的安全性。（四）实验方法选择的内容和步骤（四）实验方法选择的内容和步骤 一般化验室主要选择常规方法或使用方便的参一般化验室主要选择常规方法或使用方便的参考方法。考方法。 （1）广泛查阅文献）广泛查阅文献 根据方法选择的要求对各根据方法选择的要求对各种方法进行比较，了解各方法的科学依据和使用种方法进行比较，了解各方法的科学依据和使用价值。价值。 （2）选定候选方法）选定候选方法 根据本实验室的设备条件、根据本实验室的设备条件、人员素质、工作量等具体情况，选择合适的方法。人员素质、工作量等具体情况，选择合适的方法。 （3）候选方法的初步评价实验）候选方法的初步评价实验包括包括? 标准曲线和重复性；标准曲线和重复性； 质控血清和标本的重复试验；质控血清和标本的重复试验； 用不同浓度的标本与参考方法的结果对比。用不同浓度的标本与参考方法的结果对比。2、实验方法选择的步骤、实验方法选择的步骤 实验方法评价实验方法评价的过程就是对的过程就是对实验误差实验误差的测的测定。根据评价实验的结果和方法性能判断的标准，定。根据评价实验的结果和方法性能判断的标准，决定该方法决定该方法是否可以被接受是否可以被接受。二、二、 实验方法的评价实验方法的评价 1 1、实验误差：、实验误差：是指给出值（包括测定值和标称是指给出值（包括测定值和标称值）与客观真值的之差。值）与客观真值的之差。（一）实验误差及分类（一）实验误差及分类2 2、实验、实验误差误差的分类的分类( (一一) )实验误差的分类实验误差的分类: : 依据来源性质依据来源性质实验误差实验误差系统误差系统误差 SESE随机误差随机误差 RERE恒定系统误差恒定系统误差 CECE比例系统误差比例系统误差 PEPE （1）系统误差）系统误差表示不准确度表示不准确度 定义：定义：指一系列测定结果与真值有同一倾向的偏离。指一系列测定结果与真值有同一倾向的偏离。 特点：特点：由恒定的原因引起，具有单向性，在一定条件由恒定的原因引起，具有单向性，在一定条件下重复出现，可校正。下重复出现，可校正。又分为恒定误差（又分为恒定误差（CE）和比例误和比例误差（差（PE）。）。 是指由干扰物引起的使测定值与真值存在是指由干扰物引起的使测定值与真值存在恒定大小的误差。误差大小与被测物浓度无关，而与干扰恒定大小的误差。误差大小与被测物浓度无关，而与干扰物浓度相关。物浓度相关。：是指相对于被测物浓度有相同的百分比误是指相对于被测物浓度有相同的百分比误差，误差的绝对量与被测物浓度呈正比。差，误差的绝对量与被测物浓度呈正比。引起误差的原因：引起误差的原因： 方法误差：方法误差：最严重，最难避免最严重，最难避免； 仪器和试剂误差：仪器和试剂误差：可以采取措施避免。可以采取措施避免。 （2） 偶然误差（随机误差）：偶然误差（随机误差）： 定义：定义：是是指在实际工作中，指在实际工作中，多次重复测定多次重复测定某一物质时引起某一物质时引起的误差。的误差。 特点特点:误差没有一定的大小和方向，可正可负，数据呈正态分布；误差没有一定的大小和方向，可正可负，数据呈正态分布；具有不可预测性，不可避兔，但可控制在一定范围内；具有不可预测性，不可避兔，但可控制在一定范围内；当分析步骤越多，造成种误差的机会越多；当分析步骤越多，造成种误差的机会越多；随测定次数增加，其算术均数就越接近于真值。随测定次数增加，其算术均数就越接近于真值。由测定仪器、试剂、环境等实验条件的改变以及由测定仪器、试剂、环境等实验条件的改变以及分析人分析人员操作习惯员操作习惯等因素的变化而引起。等因素的变化而引起。引起误差的原因：引起误差的原因：223、实验误差的表示方法：、实验误差的表示方法：p平均误差：平均误差：算术平均偏差，用算术平均偏差，用dm表示表示p标准偏差（标准差）标准偏差（标准差）：表示精密度的较好的指标。：表示精密度的较好的指标。p绝对误差和绝对偏差：绝对误差和绝对偏差：dm=di/n=X- /nXdi2=N-1绝对误差绝对误差=X-T绝对偏差绝对偏差=X-Xp相对误差和相对偏差：相对误差和相对偏差：p变异系数变异系数（coefficient of variation，CV）相对误差相对误差=X-TT100%相对偏差相对偏差=X-X X100%CV= S X100比较各组数据间的变异情况比较各组数据间的变异情况CV 离散度离散度 精密度精密度（二）方法评价的步骤和方法（二）方法评价的步骤和方法 （1）评价前实验）评价前实验 研究候选方法的最适条件。包研究候选方法的最适条件。包括试剂浓度、缓冲液的种类、离子强度和括试剂浓度、缓冲液的种类、离子强度和pHpH值、值、反应的温度和时间、检测波长等。反应的温度和时间、检测波长等。 （2）初步评价初步评价 包括批内和日内重复性试验、包括批内和日内重复性试验、回收试验、干扰试验等。回收试验、干扰试验等。 （3）最后评价最后评价 包括日间重复性试验、方法比包括日间重复性试验、方法比较试验和总体判断方法是否可接受。较试验和总体判断方法是否可接受。 （4）评价后实验评价后实验 进行临床相关研究，包括参进行临床相关研究，包括参考值确定和特殊病人标本的测定等。考值确定和特殊病人标本的测定等。 （5）方法应用方法应用 建立质控系统，培训操作者，建立质控系统，培训操作者，引入常规工作等。引入常规工作等。1、实验方法评价的步骤、实验方法评价的步骤实验误差类型与方法评价实验的关系？实验误差类型与方法评价实验的关系？分析误差的类型分析误差的类型评价实验评价实验 初步实验初步实验 最后实验最后实验随机误差（随机误差（RE）批内重复实验批内重复实验日间重复实验日间重复实验恒定误差（恒定误差（CE）干扰实验干扰实验方法比较实验方法比较实验比例误差（比例误差（PE）回收实验回收实验方法比较实验方法比较实验26 1. 精密度精密度 是指对同一样品多次测定，每次测是指对同一样品多次测定，每次测定结果与均值的符合程度。定结果与均值的符合程度。是表示测定结果中是表示测定结果中随机随机误差误差大小的指标。大小的指标。 精密度有批内、日内和日间的精密度之分，表精密度有批内、日内和日间的精密度之分，表示精密度的指标有标准差（示精密度的指标有标准差（s）、）、变异系数（变异系数（CV）、）、标准误、平均偏差等。标准误、平均偏差等。 评价的方法：平行试验和重复性试验评价的方法：平行试验和重复性试验。（三）方法评价指标（三）方法评价指标(有哪些有哪些?评价方法评价方法?) 2. 准确度准确度 指测定值与真值之间的符合程度。指测定值与真值之间的符合程度。一般用偏差和偏差系数表示。准确度没有度量指标，一般用偏差和偏差系数表示。准确度没有度量指标，往往以不准确度来衡量，即重复测定的均值与真值往往以不准确度来衡量，即重复测定的均值与真值之差。准确度主要受之差。准确度主要受系统误差系统误差支配，也受支配，也受随机误差随机误差的影响。的影响。 评价方法：回收试验、干扰实验、对比试验评价方法：回收试验、干扰实验、对比试验。 3. 线性范围线性范围 是指实验方法所能检测标本中某是指实验方法所能检测标本中某物质的浓度范围。物质的浓度范围。 通过通过线性试验线性试验确定。确定。 1、重复性试验、重复性试验 目的：是考察候选方法的随机误差，目的：是考察候选方法的随机误差，评价方法评价方法的精密度的精密度。 分为：分为：批内重复性试验批内重复性试验，日内重复性试验，日内重复性试验 和和日间重复性试验日间重复性试验批内重复性试验批内重复性试验: 方法：方法：在很短的时间内对同一样品进行重复（一在很短的时间内对同一样品进行重复（一般为般为20次），次），计算计算 、S、CV， (CV一般应小于一般应小于5%)。 目的：目的：检测随机误差，衡量分析方法的精密度。检测随机误差，衡量分析方法的精密度。 X（四）评价试验（四）评价试验X 注意事项：注意事项： （1）吸量要准确。所用吸管应校正并按正规要）吸量要准确。所用吸管应校正并按正规要求操作。求操作。 （2）被测物的浓度应选择有意义的医学决定水）被测物的浓度应选择有意义的医学决定水平，同时应在该方法的线性范围内。平，同时应在该方法的线性范围内。 （3）一般宜使用高、中、低不同浓度标准液或）一般宜使用高、中、低不同浓度标准液或混合血清。混合血清。 （4）计算变异系数时，应先剔除离群点后再计）计算变异系数时，应先剔除离群点后再计算。（方法见实验讲义算。（方法见实验讲义51页）页）2、回收试验回收试验 目的：目的：是检测比例误差，以衡量分析方法的准确度。是检测比例误差，以衡量分析方法的准确度。方法：方法： 是在样品中加入一定量被测物质，然后用同是在样品中加入一定量被测物质，然后用同样方法测定，测得值与理论值之比乘以样方法测定，测得值与理论值之比乘以100%即为回即为回收率，合格的回收率应为收率，合格的回收率应为100%5 %。计算：计算：回收浓度分析标本测得浓度基础标本测得浓度回收浓度分析标本测得浓度基础标本测得浓度加入浓度加入浓度 标准液浓度标准液浓度标准液量（标准液量（ml）病人样品量标准液量（病人样品量标准液量（ml）回收率（回收率（%） 100回收浓度回收浓度加入浓度加入浓度注意事项：注意事项： （1）吸量要准确。所用吸管应校正并按正规）吸量要准确。所用吸管应校正并按正规要求操作。要求操作。 （2）加入标准液后的浓度应达到医学决定水）加入标准液后的浓度应达到医学决定水平，同时应在该方法的线性范围内。平，同时应在该方法的线性范围内。 （3）加入标准液的体积应在总体积的）加入标准液的体积应在总体积的10%以以内。内。 （4）一般应做高、中、低不同浓度标准液的）一般应做高、中、低不同浓度标准液的回收试验，计算平均回收率。回收试验，计算平均回收率。 （5）为了减少随机误差对检测比例误差的干）为了减少随机误差对检测比例误差的干扰，最好能重复测定扰，最好能重复测定23次。次。举例举例 某法测定血糖回收率的标本制备和测定结果如下：某法测定血糖回收率的标本制备和测定结果如下：（1）样本制备：）样本制备：基础样本：基础样本： 血清血清2ml蒸馏水蒸馏水0.1ml分析样本分析样本1：血清血清2ml25mmol/L葡萄糖标准液葡萄糖标准液0.1ml。分析样本分析样本2：血清血清2ml100mmol/L葡萄糖标准液葡萄糖标准液0.1ml。（2）按操作要求测定上述样本，将结果填入下表按操作要求测定上述样本，将结果填入下表血糖回收试验结果血糖回收试验结果测定浓度测定浓度 加入浓度加入浓度回收浓度回收浓度回收率回收率%基础样本基础样本5.50分析样本分析样本16.751.191.25105.0分析样本分析样本210.204.764.7099.4 回收率的理想值为回收率的理想值为100%，现在的平均回收，现在的平均回收率为率为102.2%，比例误差为比例误差为2.2%，表明当一个标，表明当一个标本的葡萄糖浓度为本的葡萄糖浓度为5.5mmol/L时，用该法测定值时，用该法测定值为为5.62mmol/L，误差为误差为0.12mmol/L（5.5mmol/L2.2%）。）。 一般要求回收率在一般要求回收率在95105之间。之间。平均回收率平均回收率 100%102.2%10599.423、干扰试验、干扰试验 目的：目的：是检测恒定误差，以衡量方法的特异性和是检测恒定误差，以衡量方法的特异性和准确度。准确度。干扰物与分析试剂反应是特异性差，若干扰物与分析试剂反应是特异性差，若不与试剂反应却影响测定值是干扰（准确度差）。不与试剂反应却影响测定值是干扰（准确度差）。方法：方法： 选混合血清标本，分成两份，其中一份标选混合血清标本，分成两份，其中一份标本中加入疑有干扰作用的物质。用候选方法对未本中加入疑有干扰作用的物质。用候选方法对未加干扰物和加入干扰物的两种标本同时测定，两加干扰物和加入干扰物的两种标本同时测定，两者之差即表示该干扰物产生的干扰所引起的误差，者之差即表示该干扰物产生的干扰所引起的误差，即干扰值。即干扰值。 干扰值分析标本测得值基础标本测得值干扰值分析标本测得值基础标本测得值注意事项：注意事项： （1）被试验的物质）被试验的物质 根据方法的原理，提出可根据方法的原理，提出可能的干扰物。一般应考虑的因素是胆红素、溶血、能的干扰物。一般应考虑的因素是胆红素、溶血、脂血、抗凝剂等。脂血、抗凝剂等。 （2）可疑干扰物的浓度）可疑干扰物的浓度 加入可疑干扰物的浓加入可疑干扰物的浓度须达到有价值的范围，有可能应达到病理标本的度须达到有价值的范围，有可能应达到病理标本的最高浓度值，在确证有影响后，应测定在何浓度时最高浓度值，在确证有影响后，应测定在何浓度时所产生的误差在临床上无意义（最低干扰浓度）。所产生的误差在临床上无意义（最低干扰浓度）。 （3）本试验检测的误差包括方法特异性不高和）本试验检测的误差包括方法特异性不高和干扰物的作用所引起的误差。干扰物的作用所引起的误差。举例举例 尿酸对尿酸对GOD-POD法测定血糖的干扰：法测定血糖的干扰：（1）样本制备：）样本制备：基础样本：基础样本： 血清血清0.9ml蒸馏水蒸馏水0.1ml分析样本分析样本1：血清血清0.9ml4mmol/L尿酸标准液尿酸标准液0.1ml。分析样本分析样本2：血清血清0.9ml8mmol/L尿酸标准液尿酸标准液0.1ml。（2）用用GOD-POD法测定上述样本，将结果填入下表法测定上述样本，将结果填入下表干扰实验检测结果（干扰实验检测结果（mmol/L）葡萄糖测得值葡萄糖测得值加入尿酸值加入尿酸值干扰值干扰值基础样本基础样本6.50分析样本分析样本16.200.400.30分析样本分析样本25.950.800.55单位浓度尿酸使葡萄糖减少值单位浓度尿酸使葡萄糖减少值干扰值干扰值1干扰值干扰值2加入尿酸值加入尿酸值1加入尿酸值加入尿酸值20.300.550.400.80 0.7mmol/L 测定表明血清尿酸测定表明血清尿酸0.4mmol/L时，可使血时，可使血糖测定结果约减少糖测定结果约减少0.28mmol/L（0.40.7）。）。消除干扰的常用方法：消除干扰的常用方法： （1）作试剂空白和标本空白试验。）作试剂空白和标本空白试验。 （2）采用物理、化学方法分离去除干扰物质。）采用物理、化学方法分离去除干扰物质。 （3）采用双波长或多波长检测方法排除干扰。）采用双波长或多波长检测方法排除干扰。4、方法对比实验、方法对比实验 目的：目的： 对比实验可检测方法的系统误差，经统计对比实验可检测方法的系统误差，经统计分析后可提供系统误差的性质，属比例误差还是恒分析后可提供系统误差的性质，属比例误差还是恒定误差。定误差。方法：对一组病人的样品同时用候选方法与参考方方法：对一组病人的样品同时用候选方法与参考方法测定，并统计量组结果有无显著性差异。（统计法测定，并统计量组结果有无显著性差异。（统计方法、配对方法、配对t检验、直线回归）一般检验、直线回归）一般P0.01者，该者，该候选方法不能采用，候选方法不能采用， 注意事项：注意事项： （1）试验样品数）试验样品数 一般做一般做40100例。最好要包例。最好要包括各种疾病的标本，即包括在常规工作中可能遇到括各种疾病的标本，即包括在常规工作中可能遇到的整个分析范围。的整个分析范围。 （2）重复分析）重复分析 一般每个样品用两种方法各测一般每个样品用两种方法各测定一次，最好能分批测定两次。两种方法及两批测定一次，最好能分批测定两次。两种方法及两批测定，在同一天进行。定，在同一天进行。 （3）实验的时间间隔）实验的时间间隔 每天测定每天测定25个样品，个样品，约约20天。天。 （4）结果的图示）结果的图示 比较方法的结果为横坐标比较方法的结果为横坐标（X），），候选方法的结果为纵坐标（候选方法的结果为纵坐标（Y），），结果结果应及时绘于坐标纸上，以便及时检查结果，发现应及时绘于坐标纸上，以便及时检查结果，发现问题。溶血、脂血、黄疸标本，应在对应的散点问题。溶血、脂血、黄疸标本，应在对应的散点上标以上标以H、L、I等符号。等符号。 统计处理统计处理（1）配对）配对t 检验：检验：用于比较两法间的系统误差。用于比较两法间的系统误差。NSdXYt 1nbiasxySd2 X，Y 表示两法的均数；表示两法的均数；YX 为偏差，为偏差，即系统误差；即系统误差；Sd是两种方法的标准差是两种方法的标准差。t 检检验对随机误差和比例误差敏感。当不存在比验对随机误差和比例误差敏感。当不存在比例误差时，例误差时， 表示随机误差，这时表示随机误差，这时t 值表示值表示系统误差相当于随机误差的倍数系统误差相当于随机误差的倍数。NSd （2）F检验：检验：用于比较方法间的用于比较方法间的随机误差或精随机误差或精密度密度。 S1、S2分别为两种方法的标准差，且分别为两种方法的标准差，且S1 S2 。如果如果F值值F 临界值，则统计学上认为两种方法的临界值，则统计学上认为两种方法的精密度有差别；精密度有差别；F值值F 临界值，则表示两种方法临界值，则表示两种方法的精密度无明显差别。的精密度无明显差别。2221SSF （3）直线回归：）直线回归：根据两法所测数据得根据两法所测数据得回归方程回归方程Y abX。a为回归线截距，为回归线截距，a = ybx仅对恒定误差敏感；仅对恒定误差敏感；a = 0时，表示无恒定误时，表示无恒定误差。差。b为回归线斜率，为回归线斜率，仅对比例误差敏感；仅对比例误差敏感；b = 1时，表示无比例误时，表示无比例误差。差。22XXnYXXYnb46方法学评价实验小结v重复性试验：重复性试验：测定候选方法的偶然误差，衡量精密度。测定候选方法的偶然误差，衡量精密度。v回收试验：回收试验：测定比例系统误差，衡量准确度测定比例系统误差，衡量准确度。v干扰试验：干扰试验：测定恒定系统误差，衡量准确度测定恒定系统误差，衡量准确度。v方法对比试验：方法对比试验：检测候选方法的系统分析误差检测候选方法的系统分析误差。 1、性能标准（指标）性能标准（指标） （1）允许分析误（）允许分析误（EA）被规定为被规定为95%样品的允样品的允许误差限度许误差限度 （2）医学决定性水平（）医学决定性水平（Xc）是指对疾病诊治具是指对疾病诊治具有参考价值的临床分析物浓度有参考价值的临床分析物浓度 。 对于某一分析物，每一医学决定性水平规定对于某一分析物，每一医学决定性水平规定相应的性能标准相应的性能标准（EA） ，即在一定，即在一定Xc值下的值下的EA值。值。（五）方法性能判断（五）方法性能判断2 2、性能判断指标、性能判断指标 单值判断指标 误差类型误差类型 判断标准判断标准 评价实验评价实验 随机误差（随机误差（RE） 1.96SEA 重复试验重复试验 比例误差（比例误差（PE） | |(R100) Xc/100| |EA 回收试验回收试验 恒定误差（恒定误差（CE） | |偏差偏差| |EA 干扰试验干扰试验 系统误差（系统误差（SE） | |（a+bXc）- - Xc| |EA 对比试验对比试验 总误差总误差（TE=RE+SE） 1.96S+| |（a+bXc）- -Xc| |EA 重复和对比重复和对比试验试验 （1 1）参考值与参考范围）参考值与参考范围的概念的概念？ 1.概念概念 是指从若干标准规定的参考人群是指从若干标准规定的参考人群中选取一定数量的参考个体检测的结果，经中选取一定数量的参考个体检测的结果，经统计学处理求得均值（统计学处理求得均值（X）和标准差（和标准差（S）。其均值即为参考值，检测结果的其均值即为参考值，检测结果的95%的分布的分布区间即为参考范围。区间即为参考范围。 2.参考范围的表示法：参考范围的表示法：正态分布一般以正态分布一般以X2S表示，偏态分布可用百分位数表示。表示，偏态分布可用百分位数表示。 （如：动脉血（如：动脉血pH：7.357.45）（2 2）医学决定水平）医学决定水平 1.概念？概念？是指对疾病诊疗具有决定性作用的临床是指对疾病诊疗具有决定性作用的临床分析物浓度。（临床对不同病情确定不同治疗方案分析物浓度。（临床对不同病情确定不同治疗方案的的 阈值）。阈值）。 2.医学决定水平通常确定三个医学决定水平通常确定三个 （1）提示需要进一步检查的阈值（待诊）；）提示需要进一步检查的阈值（待诊）； （2）提示需要进行治疗的阈值（确诊）提示需要进行治疗的阈值（确诊） （3）提示预后或需要紧急处理的阈值。）提示预后或需要紧急处理的阈值。 属于属于A ？ 属于属于B组组A DL1 DL2 组组B 2.医学决定水平与参考值的关系医学决定水平与参考值的关系 现有两组人群，现有两组人群，组组A是参考人群，所得出的参是参考人群，所得出的参考值在箭头之间，考值在箭头之间，组组B是某种疾病患者，是某种疾病患者，DL1为第为第一决定性水平，此值左侧可排除一决定性水平，此值左侧可排除B疾病，疾病，DL2为第为第二决定性水平，该值右侧可确定患者有二决定性水平，该值右侧可确定患者有B疾病，由疾病，由此可见医学决定水平与参考值不同。此可见医学决定水平与参考值不同。（三）危急值（三）危急值1.概念？概念？是提示即刻可能危及生命，需要立是提示即刻可能危及生命，需要立即采取即采取临床临床干预的测定值。从临床经验积累干预的测定值。从临床经验积累获得。获得。例如：例如：血糖血糖39.2mmol/L或或2.2mmol/L，前者，前者可能会引起高渗性昏迷，后者可能会引起低可能会引起高渗性昏迷，后者可能会引起低血糖昏迷，需要立即对患者采取紧急干预。血糖昏迷，需要立即对患者采取紧急干预。检测系统的概念？检测系统的概念？实验方法选择的目的、原则和内容实验方法选择的目的、原则和内容何谓决定性方法？参考方法？常规方法？何谓决定性方法？参考方法？常规方法？推荐方法？推荐方法？各级实验方法与标准试剂应用的关系？各级实验方法与标准试剂应用的关系？系统误差和偶然误差的定义、特点和主要原因各种方法评价指标及其评价方法有哪些？各种方法评价指标及其评价方法有哪些？思考题：思考题：第五节第五节第五节第五节第五节第五节 试剂盒的选择和评价试剂盒的选择和评价试剂盒的选择和评价试剂盒的选择和评价试剂盒的选择和评价试剂盒的选择和评价 随着检验医学和科学技术的发展，商随着检验医学和科学技术的发展，商品化的试剂盒不断涌现。如何选择和评价品化的试剂盒不断涌现。如何选择和评价高质量的、符合实验室分析要求的，以及高质量的、符合实验室分析要求的，以及使用方便和价廉的试剂盒，是检验工作者使用方便和价廉的试剂盒，是检验工作者的重要职责之一的重要职责之一第一代产品：第一代产品：20世纪世纪4050年代，是各医院实验年代，是各医院实验室自行配制简单试剂，能开展的生化检测的方法室自行配制简单试剂，能开展的生化检测的方法及检测项目有限，由于无法统一标准，准确性极及检测项目有限，由于无法统一标准，准确性极差。差。 第二代产品：第二代产品：5070年代产生，即事先配制多种年代产生，即事先配制多种试剂，使用前临时混合在一起。由于受多种技术试剂，使用前临时混合在一起。由于受多种技术的限制，这类试剂的稳定性很差，多数在冰箱内的限制，这类试剂的稳定性很差，多数在冰箱内只能保存数天，并且操作繁琐费时，容易加错试只能保存数天，并且操作繁琐费时，容易加错试剂。剂。 一、生化检验试剂的发展一、生化检验试剂的发展第三代产品：第三代产品：是干粉剂型生化试剂是干粉剂型生化试剂，也是商品，也是商品试剂开发应用的开始。试剂开发应用的开始。70年代开发研制冻干试年代开发研制冻干试剂，后来又发展成干粉试剂，剂，后来又发展成干粉试剂， 冻干试剂冻干试剂是将各种化学试剂溶解混合后，是将各种化学试剂溶解混合后，分装在不同的试剂瓶内，经冻干处理。分装在不同的试剂瓶内，经冻干处理。 干粉试剂干粉试剂是将各种干燥的化学试剂直接混是将各种干燥的化学试剂直接混合加工而成，各瓶试剂所含水量均一。合加工而成，各瓶试剂所含水量均一。 其优点是保存期较长，便于运输。缺点是其优点是保存期较长，便于运输。缺点是用前要复溶，复溶时对水质及其加入量要求很用前要复溶，复溶时对水质及其加入量要求很高，复溶后保存期短，稳定性差，各瓶间存在高，复溶后保存期短，稳定性差，各瓶间存在误差。误差。第四代产品：第四代产品：80年代末开发出年代末开发出液体型试剂液体型试剂，其中，其中分为单一试剂和双试剂，这种最新生化试剂的生分为单一试剂和双试剂，这种最新生化试剂的生产技术，使各种原来不易保存的生化试剂，不稳产技术，使各种原来不易保存的生化试剂，不稳定的酶和辅酶能够在水溶液中长期保存。定的酶和辅酶能够在水溶液中长期保存。 液体双试剂优点？液体双试剂优点？是是准确、稳定性好；抗干扰准确、稳定性好；抗干扰能力强，无需复溶，使用十分方便不易浪费。能力强，无需复溶，使用十分方便不易浪费。使用前无需准备，可直接上机使用，同样适用于使用前无需准备，可直接上机使用，同样适用于手工法。手工法。二、试剂盒的选择和评价二、试剂盒的选择和评价（一）检查包装是否完整（一）检查包装是否完整 (略略)（二）试剂质量初评（二）试剂质量初评 (略略)（三）试剂性能特征的评估（三）试剂性能特征的评估 进行评估时应特别注意，评估工作进行评估时应特别注意，评估工作应建立在严格控制实验条件的基础上，应建立在严格控制实验条件的基础上，如仪器、量器须先经校正，测定程序要如仪器、量器须先经校正，测定程序要严格控制，并由技术熟练的人员操作。严格控制，并由技术熟练的人员操作。否则容易得出错误的结论。否则容易得出错误的结论。三、试剂性能特征的评估三、试剂性能特征的评估1测定准确度测定准确度 通常用回收试验来衡量试剂盒的准确度。通常用回收试验来衡量试剂盒的准确度。作回收试验时，回收值不得超出线性范围，回收作回收试验时，回收值不得超出线性范围，回收率一般要求在率一般要求在100士士5以内。以内。 对于一些无法准确加入的待测物（如酶和一对于一些无法准确加入的待测物（如酶和一些难以得到的标准待测物）也可以用对比试验加些难以得到的标准待测物）也可以用对比试验加以衡量。方法是用被评估试剂盒和认可的标准方以衡量。方法是用被评估试剂盒和认可的标准方法同时对若干标本进行测定，计算直线回归方程法同时对若干标本进行测定，计算直线回归方程和相关系数。相关系数一般应在和相关系数。相关系数一般应在0.91.0之间，之间，否则说明其测定准确度与标准方法相差较大，直否则说明其测定准确度与标准方法相差较大，直线的截距应近于线的截距应近于0，否则说明有系统误差存在。，否则说明有系统误差存在。 2.检验精密度检验精密度 精密度常以变异系数精密度常以变异系数CV表示。表示。包括批内和批包括批内和批间变异系数两种，间变异系数两种，CV越小精密度越高。越小精密度越高。 批间精密度的批间精密度的CV值一般大于批内，低含量标值一般大于批内，低含量标本的本的CV一般大于高含量标本。批间精密度差往一般大于高含量标本。批间精密度差往往与试剂盒的稳定性和试剂的均匀性有关，但往与试剂盒的稳定性和试剂的均匀性有关，但也与标本的均匀性有关，在判断结果时应注意也与标本的均匀性有关，在判断结果时应注意排除标本非均匀性的影响。排除标本非均匀性的影响。3.干扰物试验干扰物试验 通过试验观察试剂对干扰物影响的耐受程度。通过试验观察试剂对干扰物影响的耐受程度。 通常取一混合标本，从中分出几份，分别加人通常取一混合标本，从中分出几份，分别加人不同已知量的干扰物，然后测定出不同干扰物浓不同已知量的干扰物，然后测定出不同干扰物浓度下的待测物量，比较其测定结果，从各自的偏度下的待测物量，比较其测定结果，从各自的偏差程度即可了解这一干扰在试剂盒测定中的干扰差程度即可了解这一干扰在试剂盒测定中的干扰程度。程度。 商品试剂盒均应标明干扰物的种类及干扰的程商品试剂盒均应标明干扰物的种类及干扰的程度，用户不仅可对这些干扰物进行评价，也可根度，用户不仅可对这些干扰物进行评价，也可根据实际工作的需要对其它可能的干扰物进行评估。据实际工作的需要对其它可能的干扰物进行评估。 4.测定线性范围测定线性范围 商品试剂盒的线性测定范围既是衡量其质量的商品试剂盒的线性测定范围既是衡量其质量的重要指标，也是保证正确使用和鉴定试剂盒的关重要指标，也是保证正确使用和鉴定试剂盒的关键指标之一。键指标之一。 一般试剂盒的线性范围要求能覆盖临床上的参一般试剂盒的线性范围要求能覆盖临床上的参考值和常见疾病的医学决定水平，以减少标本稀考值和常见疾病的医学决定水平，以减少标本稀释重测的机会。释重测的机会。一旦线性范围变窄（通常是上限一旦线性范围变窄（通常是上限降低），该试剂盒即应废弃。造成试剂盒线性变降低），该试剂盒即应废弃。造成试剂盒线性变窄的常见原因有：窄的常见原因有：生产中组分投料量不足，生产中组分投料量不足，生产后组分稳定性差，运输、贮存不当，生产后组分稳定性差，运输、贮存不当，从而从而导致试剂盒组分的含量发生变化。导致试剂盒组分的含量发生变化。 5.稳定性试验稳定性试验 试剂盒的稳定性：试剂盒的稳定性：是指试剂盒试剂的不同状态是指试剂盒试剂的不同状态在不同条件贮存后所保持其测定准确性的性能在不同条件贮存后所保持其测定准确性的性能。 大多数试剂盒具有原包装形式和使用时的工作大多数试剂盒具有原包装形式和使用时的工作液两种形式，少数试剂盒的原包装即为工作液。液两种形式，少数试剂盒的原包装即为工作液。评估试剂盒的稳定性应包括原包装和工作液在试评估试剂盒的稳定性应包括原包装和工作液在试剂盒指定条件下的稳定性。剂盒指定条件下的稳定性。 原包装形式有多种，如原包装形式有多种，如液体型、干粉型、冻液体型、干粉型、冻干型、胶囊型干型、胶囊型等。其保存期较长，而当配成工作等。其保存期较长，而当配成工作液后，其保存期一般较短。生产厂家在试剂盒的液后，其保存期一般较短。生产厂家在试剂盒的研制过程中，都已做过稳定性试验，并加有适当研制过程中，都已做过稳定性试验，并加有适当的稳定剂。但用户在选择和鉴定试剂盒时，仍需的稳定剂。但用户在选择和鉴定试剂盒时，仍需要检查其稳定性，尤其是在使用中发现测定结果要检查其稳定性，尤其是在使用中发现测定结果偏低时。偏低时。 试剂盒的稳定性与贮存条件密切相关，工作试剂盒的稳定性与贮存条件密切相关，工作液的稳定性还和使用中污染与否有关，在评估时液的稳定性还和使用中污染与否有关，在评估时须保持指定条件贮存并要严防污染。须保持指定条件贮存并要严防污染。 本章小结本章小结本章小结 1.实验方法分级（决定性方法、参考方法、常实验方法分级（决定性方法、参考方法、常规方法），规方法）， 2.实验方法选择的原则（实用性、可靠性）实验方法选择的原则（实用性、可靠性） 3.方法评价指标（精密度、准确度、特异性、方法评价指标（精密度、准确度、特异性、检测能力），评价实验（重复性试验、回收试验检测能力），评价实验（重复性试验、回收试验、干扰试验、对比试验）。、干扰试验、对比试验）。 4.参考值和医学决定水平（概念、两者的关系参考值和医学决定水平（概念、两者的关系） 5. 试剂盒的选择和评价试剂盒的选择和评价（包装是否完整、试剂（包装是否完整、试剂质量初评、试剂性能特征评估）质量初评、试剂性能特征评估） 。 复习思考题复习思考题复习思考题 1. 实验方法的评价指标主要有哪些？实验方法的评价指标主要有哪些？ 2. 常用的评价实验有哪些？各有何用途？常用的评价实验有哪些？各有何用途？ 3. 何谓参考范围与医学决定水平？何谓参考范围与医学决定水平？ 参考文献：参考文献：参考文献：参考文献：参考文献：参考文献：现代临床生物化学检验现代临床生物化学检验主编主编 张秀明张秀明 人民军医出版社人民军医出版社临床生物化学及生物化学检验临床生物化学及生物化学检验主编主编 周周 新新 人民卫生出版社人民卫生出版社结束结束结束结束结束结束预习内容：预习内容：预习内容：预习内容：预习内容：预习内容：第四章第四章 生物化学检验的质量控制生物化学检验的质量控制