[DOC] 一株从银杏内种皮分离的细菌的鉴定及其发酵产过氧化氢酶研究

一株从银杏内种皮分离的细菌的鉴定及其发酵产过氧化氢酶研究北麈业掌揠2O11,20(9):174179ActaAgriculturaeBorealioccidentalisSinica一株从银杏内种皮分离的细菌的鉴定及其发酵产过氧化氢酶研究李婷婷,蔡宇杰,廖祥(1.江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡儒,尹静,张大兵.214122;2.江苏汉邦科技有限公司,江苏淮安223001)摘要:应用形态学,生理生化和16SrRNA基因序列分析方法,鉴定从银杏内种皮分离得到的一株细菌;并利用液态发酵法探讨碳,氮源等对该菌产过氧化氢酶的影响.结果显示,该菌可归人沙雷氏菌属,其最适碳源为葡萄糖,最适氮源为玉米浆粉;胞内产过氧化氢酶为低温过氧化氢酶,产量可达8062.22U/mL发酵液关键词:过氧化氢酶;细菌鉴定;发酵;SerratiamarcescensSYBCTO2中图分类号:Q93文献标志码:A文章编号:10041389(2011)09017406IdentificationofaBacteriumIsolatedfromtheEndopleuraofGinkgobilobaL.andItsFermentationforCatalaseProductionLITingting,CAIYujie,LIAOXiangru,YINJingandZHANGDabing(1.TheKeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversityWuxiJiangsu214122,China;2.JiangsuHanbonScience&TechnologyCo.Ltd,HuaianJiangsu223001,China)Abstract:Morphologicalaspects,physiologicalandbiochemicalcharactersand16SrRNAsequenceanalysiswereusedtoidentifythebacteriumisolatedfromtheendopleuraofGinkgobilobaL.andliquidstatefermentationwasutilizedtoevaluatetheeffectofcarbonandnitrogenresourcesandotherfactoronitscatalaseproduction.ThedatashowedthatthebacteriumisolatedwasbelongedtothegenusSerratiaanddesignatedasSerratiamarcescensSYBCT02,theoptimalcarbonandnitrogenresourcewasglucoseandcornsteeppowder,andtheyieldofintrocellularcatalasewascoldadaptedcatalaseandcouldreach8062.22U/mL.Keywords:Catalase;Bacteriumidentification;Fermentation;SerratiamarcescensSYBCT02随着社会环境保护意识的增强,过氧化氢在纸浆漂白,纺织和食品工业等领域的应用已经得到广泛认同_1.但过氧化氢本身对生物也有极大危害,因此如何分解工业加工中过多的过氧化氢已经受到世界各国的关注.过氧化氢酶高效,专一催化过氧化氢分解为氧气和水,但其在环境保护中的应用受到其生产原料和成本的极大限制.过氧化氢酶广泛存在于不同生物的细胞中3,依据其酶学特性,可将细菌的过氧化氢酶分为3种E:含血红素的单功能过氧化氢酶,含血红素的双功能过氧化氢酶,和不含血红素的过氧化氢酶.已经发现许多好氧或兼性好氧细菌有较高的产过氧化氢酶能力,如Escherichiacoli_5,Bacillussubtilis,StreptomycescoelicolorE7-8,根瘤菌,Azotobactervinelandiil1等.也有研究报道,从嗜盐l_】,嗜热口.和嗜冷微生物l1.I_中可分离得到一些酶学性质独特的过氧化氢酶.尤其是低温过氧化氢酶,可用于低温下催化环境中过氧化氢降解,有利于节约能源.但低温酶往往稳定性差,低温酶产生菌多为嗜冷菌,其生收稿日期:20101012修回日期:20101205基金项目:国家”863”计划项目(2010AA101501).第一作者:李婷婷,女,硕士研究生,研究方向为生物大分子的结构,功能与制备.通讯作者:廖祥儒,博士,教授,博士生导师.期李婷婷等:一株从银杏内种皮分离的细菌的鉴定及其发酵产过氧化氢酶研究长缓慢,低温酶异源表达也较困难1.本试验从银杏内种皮分离得到一株高产低温过氧化氢酶的嗜温细菌,并对其进行鉴定,初步研究其发酵产酶情况和粗酶性质.1材料与方法1.1菌株分离银杏种子经体积分数为7O乙醇浸泡1rain后,用无菌小钳打开后取内种皮呈红色的种子;用无菌的镊子剥取红色内种皮,置于含25mLLB培养基(蛋白胨10g/L,酵母膏5g/L,NaC110g/L,pH7.O)的三角瓶中,在30oC200r/rain下震荡培养20h.将培养物稀释1O.倍,涂布于LB平板,挑取单菌落再划线于LB平板,挑取单菌落保存于LB斜面培养基中备用.1.2形态学和生理生化特征鉴定将筛选到的菌株划线于LB固体培养基,3O培养12d,观察单菌落形态.并在电子显微镜下观察菌株的细胞形态.参照文献17和E18中的方法进行生理生化鉴定.脂肪酸组成采用HPLC法进行分析.1.316SrRNA的PCR扩增及分析细菌总DNA的提取见参考文献19.以细菌DNA为模板,519F:5一CAGCAGCCGCGGTAATAC一3和519R:5一CGATTACTAGCGATTCC一3Do,分别进行扩增.PCR反应条件为:95预变性4min,94变性1min,52退火1rain,72延伸复性90S,35个循环后于72继续延伸6rain,12保温10rain.PCR产物测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成.将测序结果在NCBI中进行Blast后交送GenBank,与其中已有序列进行系统发育分析.1.4发酵产酶1.4.1种子培养250mL的三角瓶装液量为50mL,从平板接人一环菌,30下于旋转式摇床200r/min摇瓶培养8h.1.4.2发酵产酶在250mL的三角瓶装液50mL,接人培养8h的种子菌悬液,接种体积分数为1O,旋转式摇床200r/rain摇瓶发酵,不同培养条件下培养10h.1.4.3酶的制备取一定量发酵液在108OOg条件下冷冻离心15rain,菌泥以50mmol/L的K2HPOKHzPO缓冲液(pH7.O)洗涤2次,以适量相同的缓冲液重悬后置冰浴预冷.超声波破碎(工作1S,停3S,总工作时间为10rain,功率为300w),在15000g冷冻离心20min,上清液即为胞内过氧化氢酶粗酶液.1.5过氧化氢酶活力测定参考钱斯亮等21的方法,酶活力定义为1rain分解1bLmolH2O所需酶量为1个酶活力单位(U).1.6数据分析采用软件SSPS12.5进行数据分析,所有数据来自最少3个独立试验,并各有至少3个重复.2结果与分析2.1菌落和细菌形态菌株在LB固体培养基上3O培养1d后出现红色菌落,2d后菌落颜色加深,呈深红色,菌落直径约4mm,不透明,圆形,中间稍隆起,粘稠,边缘整齐光滑.培养的细胞经扫描电镜观察,细胞呈短杆状,长约1.5m,直径约0.5m,端圆(图1).其菌落形态和细胞形态符合沙雷氏菌属的特征.2.2菌株的生理生化鉴定结果由表1可知,该菌为革兰氏阴性,VP反应阳性,接触酶反应阳性,能发酵多种糖类产酸,其大部分生理生化特性与格氏沙雷氏菌(Serratiamarcescens)最为接近,但与粘质沙雷氏菌也很相近;而其利用蔗糖,乳糖产酸时,与格氏沙雷氏菌略有不同.由表2可知,该菌的主要脂肪酸为16:0(17.19),10:030H(15.51),17:0cyclo(11.76),14:030H/16:1ISOI(10.77)和图1SerratiamarcescensSYBCT02菌株的电镜照片Fig.1ElectronicmicroscopediagramofthestrainSerratiamarcescensSYBCT02?176?西北农业2O卷表1SerratiamarcescensSYBCT02菌株的生理生化特征Table1ThephysiologicalandbiochemicalcharactersofthestrainSerratiamarcescensSYBCT02注:+为阳性,一为阴性,d为棕色(弱阳性).Note:+meanspositive,一meansnegative,dmeansbrown(weakpositive)一种未知成分(11.O1),与鉴定的其他沙雷氏菌均不相同,因此将其命名为SerratiaSYBCT02.2.3分子鉴定提取总DNA,以PrimerA和PrimerB为引物扩增菌株SerratiaSYBCT02的16SrRNA基因部分片段.测序结果显示,序列与Serratiamarcescens的16SrRNA基因的相似性超过99.根据S.marcescens的16SrRNA基因序列设计引物Primer01和Primer02,PCR扩增获得1505个碱基的基本完整序列,利用Blast软件将该序列(待提交GenBank)与GenBank中收集的所有细菌基因进行比对,结果显示SerratiaSYBCT02的16SrRNA基因序列与SerratiamarcescensstrainA3的16SrRNA基因序列相似性最高,为99.9,结合生理生化等特性,确定SerratiaSYBCT02属于Serratiamarcescens,因此最终定名为SerratiamarcescensSYBCT02.2.4碳源对发酵产过氧化氢酶的影响分别以等摩尔碳的淀粉,葡萄糖,果糖,麦芽糖,乳糖和蔗糖为碳源,以蛋白胨为氮源发酵,菌株产过氧化氢酶水平不尽相同(图2).其中以葡萄糖为碳源时最有利于该菌产过氧化氢酶,其次为蔗糖,再就是麦芽糖和果糖,作用最小的是淀粉和乳糖.2.5氮源对发酵产过氧化氢酶的影响以葡萄糖为碳源,分别以等摩尔氮的蛋白胨,酵母膏,牛肉膏,玉米浆粉,豆粕,尿素和茶籽粕为氮源发酵,菌株产过氧化氢酶的情况如图3所示.结果表明,玉米浆粉最有利于该菌产过氧化氢酶,其次为蛋白胨和酵母膏,再者为牛肉膏,尿素,茶籽粕不利于产酶.2.6温度对发酵产酶的影响以葡萄糖和玉米浆粉分别为碳源和氮源的培养基,在不同温度下震荡培养10h,菌株发酵产过氧化氢酶的情况见图4.图4说明该菌产过氧化氢酶的最适温度为33,与其最适生长温度相近.l23456碳源Carbonsources1.淀粉Starch;2.葡萄糖Glucose;3.果糖Fructose;4.麦芽糖Maltose;5.乳糖Lactose;6.蔗糖Sucrose图2碳源对SerratiamarcescensSYBCT02产过氧化氢酶的影响Fig.2EfctofcarbonresourcesONcatalascidtype脂肪酸相对含量/RelativecontentofacidSYBC08SYBCT02注:SYBC08为SerratiamarcescensSYBC08,保存于中国科学院微生物研究所国家菌种保藏中心,编号为CGMCC3449.Note:SYBCT08isSerratiamarcescensSYBC08,preservedinChinaGeneralMicr0bi0l0gicalCultureCollectionCenter,anditsnesoncatalaseproductionofSerratiamarcescensSYBCT021000080006000400020000温度/Temperature图4温度对SerratiamarcescensSYBCT02产过氧化氢酶的影响Fig.4EffectoftemperatureoncatalaseproductionofSerratiamarcescensSYBCT0212O100s.棼60靛薯tMicrococcuslysodeiktiousPenicilliumvariabileAspergillusnigerSaccharomycescerevisiaePseudomonadVibriorumoiensis嗜热子囊菌TherlnoaSCU$aurantiacus中国科学院微生物研究所ChinaGeneralMierobiologicalCultureCollectionCenter江南大学JiangnanUniversity苏州大学生命科学学院SchoolofLifeSciences,SuzhouUniversity意大利Basilicata大学ItalyBasilicataUniversity波兰,MariaCurieSklodowska大学MariaCurieSklodowskaUniversity印度,中央食品技术研究院India,CentralInstituteofFoodTechnology瑞典,HeinoKuuskSweden,HeinoKuusk日本,早稻田大学Japan,WasedaUniversity江南大学JiangnanUniversity14OU/mL185U/mL292U/mL735U/mL78U/mL104U/g161U/mL321U/mg2762U/mLShakingflaskfermentation发酵罐Fermenter摇瓶Shakingflaskfermentation发酵罐Fermenter发酵罐Fermenter发酵罐Fermenter摇瓶Shakingflaskfermentation摇瓶Shakingflaskfermentation发酵罐Fermenter注:*表示每克湿菌体,*表示每毫克细胞.Note:*meanscellstrainpergram,*meansceilspermilligram.2.7粗酶的特性分析由图5,6可见,该菌过氧化氢酶最适pH为9,最适温度为5O在0时酶活为最适温度的64.85,说明应有低温过氧化氢酶的存在.童羹温度/Temperature图6温度对SerratiamarcescensSYBCT02过氧化氢酶活性的影响Fig.6EffectoftemperatureoncatalaseactivityofSerratiamarcescensSYBCT023讨论通过形态鉴定,生理生化特性比较和16SrRNA基因序列分析,从银杏内种皮分离得到的细菌SYBCT02既不同于格氏沙雷氏菌,也不同于现有的粘质沙雷氏菌菌株,鉴于其16SrRNA基因序列明显接近粘质沙雷氏菌,将其归属于沙雷氏菌属的粘质沙雷氏菌,定名为SerratiamarcescensSYBCT02.从发酵产过氧化氢酶的情况来看,菌株SerratiamarcescensSYBCT02的最佳碳氮源分别为葡萄糖和玉米浆粉,最适温度为33.在碳源和氮源分别为葡萄糖及玉米浆粉时,产酶可达到8062.22U/mI,比活力达613.24U/mg,与国内外产过氧化氢酶菌株相比有一定优势E(表3).从粗酶的性质来看,该菌所产过氧化氢酶为碱性过氧化氢酶,基于其在0时仍能保持最适温度时的64.85,该菌应该能够产生低温过氧化氢酶,相比于国内外大多数过氧化氢酶菌株,更具备工业价值.因此,SerratiamarcescensSYBCT02属于能够产低温过氧化氢酶的嗜温菌.至于该菌产过氧化氢酶的发酵调控,所产酶的酶学性质及分子特征等还有待进一步研究.参考文献:Eli刘冰,梁婵娟.生物过氧化氢酶研究进展EJ.中国农学通报,2005,21(5):223224./-23ZamockyM.FurtmullerPG,Obinc.EvolutionofcatalasesfrombacteriatohumansEJ.Antioxidant8LRedoxSignaling,2008,10:15271548.E33LoshehaginOV.KovalenkoRI.PossibleroleofcatalaseinadaptationtOdivingofsemiaquaticrodentsondatrazibethicaJ.EvolutionaryBiochemistryandPhysiology,2002,38:9095.r4CheIlkaniP,FitaI,LoewenPC.Diversityofstructuresand9期李婷婷等:一株从银杏内种皮分离的细菌的鉴定及其发酵产过氧化氢酶研究?179?Esl67893101112i33propertiesamongcatalasesJ.CellMolLifeSci,2004,61:192-208.ClaiborneA,Fridovichi.PurificationoftheodianisidineperoxidasefromEscherichiacoliBJ.JBiolChem,1979,254:4245-4252.LoewenPC,SwitalaJ.MultiplecatalasesinBacillussubtilisJ.JBacteriol,1987,169:36013607.ChoYH,RoeJH.IsolationandexpressionofthecatAgeneencodingthemajorvegetativecatalaseinStreptomycescoelicolorMailerJ.JBacteriol,1997,179:40494052.Kim,HP,LeeJS,HahYC,eta1.Characterizati0nofthemajorcatalasefromStreptomycescoelicolorATCC10147EJ.Microbiol,1994,140:339卜3397.HanyuM?FujimotoH,TejimaK,eta1.FunctionalDifferencesofTwoDistinctCatalasesinMesorhizobiumlotiMAFF303099underFreeLivingandSymbioticConditionsJ.JBacteriol,2009,191:14631471.SandercockJR,PageWJ.IdentificationofTwoCatalasesinAzotobactervinelandii:aKatGHomologueandanovelbacterialeytochromeccatalase,CCCAvJ.JBacteriol,2008,190:954962.BrownPetersonNJ,SalinML.PurificationandcharacterizationofamesophiliccatalasefromthehalophilicbacteriumHalobacteriurnhalobiumJ.JBacteriol,1995,177:37884.LoprasertS,NegoroS,OkadaH.ThermostableperoxidasefromBacillusstearotherraophilusJ.JGenMicrobiol,1988,134:19711976.KagawaM,MurakoshiN.NlshikawaY,eta1.Purificationandcloningofathermostablemanganesecatalasefroma14151161731831912o2122thermophilicbacteriumJ.ArchBiochemBiophys,1999,362:346-355.YumotoI,IchihashiD,1wataH,eta1.Purificationandcharacterizati0nofacatalasefromthefacuhativelypsy-chrophilicbacteriumVibriorumoiensisS-1(T)exhibitinghighcatalaseActivityJ.JBacteriol,2000,182;19037909.LorentzenMS,MoeE,JouveHM,eta1.ColdadaptedfeaturesofV/briosalmonicidacatalase!characterisati0nandcomparisontothemesophiliccounterpartfromProteusmirabilisJ.Extremophiles,2006,10:427440.ChuHD,LeederJG,GilbertSG.ImmobilizedcatalasereactorforuseinperoxidesterilizationofdairyproductsJ.JFoodSei,2006,40(3):641643.布坎南RE,吉本斯NE.伯杰氏细菌鉴定手册M.中国科学院微生物研究所伯杰细菌鉴定手册翻译组,译.北京:科学出版社,1984:453454.诸葛健,王正祥.工业微生物实验技术手册M.北京:中国轻工业出版社,1994:145178.黄培堂.分子克隆M.北京:北京科学技术出版社,2002:485486.WeisburgWG,BarnsSM,PelletierDA,eta1.16SribosomalDNAamplificationforphylogeneticstudyJ.Bacteriol,1991,173:697703.钱斯亮,蔡宇杰,廖祥儒,等.热稳定性过氧化氢酶高产菌的筛选,鉴定及酶学性质研究J.西北农业,2008,17(2):238242,王明星.纺织用碱性耐热过氧化氢酶的微生物法生产及保存稳定性的研究D.无锡:江南大学生物工程学院,2005.常见废弃量名称与标准量名称对照表废弃量名称标准量名称比重体积质量,质量密度,相对体积质量,相对密度绝对温度,开氏温度热力学温度比热电流强度电量分子量重量百分数,重量百分浓度体积百分数,体积百分浓度摩尔浓度,当量浓度粒子剂量放射性强度,放射性质量热容,比热容电流电荷量相对分子质量,分子质量质量分数体积分数物质的量浓度,浓度粒子注量放射性活度