微生物的培养与应用学案 精校版

考纲要求展示知识内容要求微生物的分离和培养某种微生物数量的测定培养基对微生物的选择作用 知识网络构建 一、微生物的实验室培养1. 培养基(1)概念：人们按照微生物对_的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。(2)成分：一般都含有碳源、_、水和_，还需要满足不同微生物生长对_、特殊营养物质以及_的要求。2. 无菌技术(1)含义：指在培养微生物的操作中，所有_的方法。(2)关键：防止外来_的入侵。(3)方法：消毒：_、化学药剂消毒法、_。灭菌：_灭菌、干热灭菌、_灭菌。 3. 实验操作(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基过程：计算、_、溶化、_、倒平板。(2)纯化大肠杆菌的原理：在培养基上将细菌稀释或分散成_，形成单个菌落，此菌落是由一个细胞繁殖而来的子细胞群体。(3)微生物的常用接种方法：_和稀释涂布平板法，接种过程仍然是_操作。二、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1. 分离原理：土壤中细菌之所以能分解尿素，是由于它们体内能合成_，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到_作用。 2. 统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用_。3. 实验流程：土壤取样、制备_、微生物的培养与观察、细菌的计数。三、分解纤维素的微生物的分离1. 纤维素酶的组成：一种_，它至少包括三种组分，即C1酶、_酶和_酶。2. 筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生_来筛选纤维素分解菌。3. 实验操作步骤：土壤取样、_、_、将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上、_。 【自我校对】一、1. (1)营养物质 (2)氮源 无机盐 pH 氧气 2. (1)防止杂菌污染 (2)杂菌 (3)煮沸消毒法 紫外线消毒法 灼烧 高压蒸汽 3. (1)称量 灭菌 (2)单个细胞 (3)平板划线法无菌二、1. 脲酶 催化 2. 稀释涂布平板法 3. 培养基三、1. 复合酶 Cx 葡萄糖苷 2. 透明圈 3. 选择培养 梯度稀释 挑选产生透明圈的菌落 微生物的培养一、培养基的类型及其应用标准培养基类型配制特点主要应用物理性质固体培养基加入琼脂较多菌种分离，鉴定，计数半固体培养基加入琼脂较少菌种保存液体培养基不加入琼脂工业生产，连续培养化学组成合成培养基由已知成分配制而成，成分明确菌种分类、鉴定天然培养基由天然成分配制而成，培养基成分不明确工业生产，降低成本 目的用途鉴别培养基添加某种指示剂或化学药剂菌种的鉴别选择培养基添加(或缺少)某种化学成分菌种的分离 二、培养基的营养构成营养物质定义作用主要来源碳源能提供碳元素的物质构成生物体的物质，异养生物的能源物质无机物：CO2、NaH CO3有机物：糖类、脂肪酸、石油、花生粉饼等氮源能提供氮元素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮代谢产物无机物：N 2、NH 3、氨盐、硝酸盐有机物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子生长不可少的微量有机物酶和核酸的成分维生素、氨基酸、碱基等 (1)微 生 物 最 常 利 用 的 碳 源 是 糖 类 (特 别 是 葡 萄 糖 )， 常利 用 的 氮 源 是 氨 盐 、 硝 酸 盐 。(2)在 微 生 物 所 需 要 的 化 合 物 中 需 要 量 最 大 的 是 碳 源 。(3)微 生 物 之 所 以 需 要 补 充 生 长 因 子 ， 是 由 于 缺 乏 合 成这 些 物 质 所 需 要 的 酶 或 合 成 能 力 有 限 。 三、无菌技术1. 消毒与灭菌的区别灭菌方法条件结果常用方法消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法，还有化学药剂(如酒精、氯气、石炭酸等)消毒、紫外线消毒灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢 子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌 2. 实验室常用灭菌方法的比较灭菌方法适用对象所需条件灭菌时间灼烧灭菌接种的金属工具(如接种针、接种环)在酒精灯的火焰外焰灼烧直至烧红干热灭菌耐高温需干燥的物品(如玻璃器皿、金属用具)干热灭菌箱内160170 12 h高压灭菌培养基100 kPa；121 1530 min 1. 芽 孢 是 细 菌 发 育 后 期 形 成 的 休 眠 体 ， 耐 高 温 ， 故 消 毒 仅 杀死 物 体 表 面 或 内 部 一 部 分 对 人 体 有 害 的 微 生 物 而 不 包 括 其 芽孢 和 孢 子 。2. 灭 菌 和 消 毒 的 实 质 大 都 是 使 微 生 物 的 蛋 白 质 或 核 酸 发 生 变性 。3. 微 生 物 分 离 中 的 无 菌 技 术 ： 获 得 纯 净 培 养 物 的 关 键 是 防 止杂 菌 污 染 ， 无 菌 技 术 可 从 如 下 四 个 方 面 展 开 ：(1)对 实 验 操 作 的 空 间 ， 操 作 者 的 衣 着 和 手 进 行 清 洁 和 消 毒 。(2)将 用 于 微 生 物 培 养 的 器 皿 、 接 种 用 具 和 培 养 基 等 进 行 灭 菌 。(3)为 避 免 周 围 环 境 中 微 生 物 的 污 染 ， 实 验 操 作 应 在 酒 精 灯 火焰 附 近 进 行 。(4)实 验 操 作 时 ， 应 避 免 已 经 灭 菌 处 理 的 材 料 用 具 与 周 围 的 物品 相 接 触 。 【例1】下列说法正确的是()A. 培养基是为微生物的生长繁殖提供营养基质的B. 培养基只有两类，液体培养基和固体培养基C. 除水以外的无机物只能提供无机盐 D. 无机氮源不可能提供能量【解析】根据培养基的物理性质，可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基，在液体培养基中加入不同量的凝固剂可形成半固体或固体培养基；除水以外的无机物如NH4HCO3，既可以是碳源，也可以是氮源，不仅仅能提供无机盐；无机氮源有时也能提供能量，如NH3可以为硝化细菌提供能量。【答案】A 1. 培养基的配制原则目的要明确：根据微生物的种类、培养目的选择不同的原料配制培养基。营养要协调：配制培养基时要注意各营养物质的浓度和比例、pH要适宜。2. 培养基的营养构成各种培养基的具体配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。不同培养基还要满足不同微生物对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。 1. (2011合肥质检)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的下列操作中，不正确的是()A. 操作流程是计算、称量、溶化、灭菌和倒平板B. 将称好的牛肉膏连同称量纸一同倒入烧杯中再加水，去纸C. 灭菌后向牛肉膏蛋白胨溶液中加2%琼脂，并使其溶解D. 将培养基冷却到约50度时，在酒精灯火焰附近倒平板【解析】牛肉膏蛋白胨培养基的操作步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板；将称好的牛肉膏与称量纸一同放在烧杯中，加入少量水，加热，牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒捞出称量纸；灭菌前将蛋白胨和氯化钠加入烧杯；等培养基冷却到50度左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。【答案】C 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、实验原理1. 筛选菌株：常用选择培养基。2. 统计菌落数目：测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。3. 设置对照。 二、实验流程1. 土壤取样：一般在距地表约38 cm的土壤层取样(富含有机物、潮湿、pH7)。2. 制备培养基：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。3. 微生物的培养与观察：将土样以1、101、102依次等比稀释至107稀释度，按照浓度从低到高的顺序涂布平板。注明培养基种类、培养日期以及平板培养样品的稀释度。将涂布好的培养皿放在30 温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。4. 细菌的计数：当菌落数目稳定时，进行计数，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。求出平均值，根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。 【例2】某同学在101、102、103倍稀释液的平均菌落数为2 760、295和46，则菌落总数(个/mL)为()A. 2.76104B. 2.95104C. 4.6104 D. 3.775104【解析】菌 落 计 数 法 ， 注 意 是 计 算 不 同 稀 释 度 的 平 均 菌 落 数 。 首先 选 择 平 均 菌 落 数 在 30 300之 间 的 ， 当 只 有 一 个 稀 释 倍 数 的 平均 菌 落 数 符 合 此 范 围 时 ， 则 以 该 平 均 菌 落 乘 以 稀 释 倍 数 即 为 该 样品 的 细 菌 总 数 ； 若 有 两 个 稀 释 倍 的 平 均 菌 落 数 均 在 30 300之 间 ，则 按 两 者 菌 落 总 数 之 比 值 来 决 定 ， 若 比 值 小 于 2应 采 取 两 者 的 平均 数 ， 若 大 于 2， 则 取 其 中 较 小 的 菌 落 总 数 。 本 题 295、 46在 30300之 间 ， 46103与 29510 2比 值 为 1.6， 应 取 二 者 平 均 数(46103 295102) 2 3.775104。 若 所 有 稀 释 倍 数 的 菌 落 数均 不 在 30 300之 间 ， 则 应 以 最 接 近 300或 30的 平 均 菌 落 乘 以 稀 释倍 数 。【答案】D 微生物计数规则1. 选 择 菌 落 数 在 30 300的 平 板 计 数 。2. 若 某 两 个 或 多 个 稀 释 浓 度 下 获 得 的 菌 落 数 均 符 合 条 件 时 ，再 看 两 者 菌 落 数 的 比 值 ， 若 小 于 2， 则 取 两 者 的 平 均 值 ；若 大 于 2， 则 取 最 小 值 。3. 计 算 方 法 ： 每 克 样 品 中 的 菌 落 数 (C/V)M。C： 某 一 稀 释 度 下 平 板 上 生 长 的 平 均 菌 落 数 ； V： 涂 布 平板 所 用 稀 释 液 的 体 积 (mL)； M： 稀 释 倍 数 。 2. 用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是()A. 涂布了一个平板，统计的菌落数是230B. 涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238C. 涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163D. 涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233【解析】在 设 计 实 验 时 ， 一 定 要 涂 布 至 少 3个 平 板 ， 才 能 增 强 实验 的 说 服 力 与 准 确 性 。 C项 虽 涂 布 了 3个 平 板 ， 但 是 ， 其 中 1个 平板 的 计 数 结 果 与 另 两 个 相 差 太 远 ， 说 明 在 操 作 过 程 中 可 能 出 现了 错 误 ， 因 此 ， 不 能 简 单 地 将 3个 平 板 的 计 数 值 用 来 求 平 均 值 。【答案】D 分解纤维素的微生物的分离一、实验原理二、实验流程土壤取样选择培养(此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定)梯度稀释将样品涂布到鉴别 纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落。 【例3】纤维素分解菌的筛选原理是()A. 刚果红可以与纤维素形成红色复合物B. 刚果红可以与水解的纤维二糖和葡萄糖形成红色复合物C. 刚果红可以与纤维素酶形成红色复合物D. 刚果红可以与纤维素分解菌结合形成红色复合物【解析】刚 果 红 是 一 种 染 料 ， 它 可 以 与 像 纤 维 素 这 样 的多 糖 物 质 形 成 红 色 复 合 物 ， 但 并 不 和 水 解 后 的 纤 维 二 糖和 葡 萄 糖 发 生 这 种 反 应 。 刚 果 红 也 不 与 纤 维 素 酶 或 者 与纤 维 素 分 解 菌 结 合 形 成 红 色 复 合 物 。【答案】A 选 择 培 养 的 目 的 是 增 加 纤 维 素 分 解 菌 的 浓 度 ， 确 保 能够 从 样 品 中 分 离 到 所 需 要 的 微 生 物 。涉 及 到 微 生 物 技 术 主 要 有 ： 培 养 基 的 配 制 、 无 菌 操 作技 术 、 稀 释 涂 布 平 板 法 、 选 择 培 养 基 的 作 用 、 土 壤 取样 等 。 3. 分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误的是()A. 经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上B. 富集培养这一步可省略，但培养纤维素分解菌少C. 经稀释培养后，用刚果红染色D. 对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上【解析】经 选 择 培 养 后 ， 再 经 稀 释 ， 才 能 将 样 品 涂 布 到 鉴别 纤 维 素 分 解 菌 的 培 养 基 上 ； 富 集 培 养 可 省 略 ； 经 稀 释 培养 后 ， 用 刚 果 红 染 色 ； 设 置 对 照 能 证 明 经 富 集 培 养 的 确 得到 了 欲 分 离 的 微 生 物 。【答案】A