蛋白质的共价结构

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第4章 蛋白质的共价结构Chapter 4.The covalent structure of protein,蛋白质（protein）是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题。,一、蛋白质通论,（一）蛋白质的元素组成与分类,蛋白质主要元素组成：,C,、,H,、,O,、,N,、,S,及,P,、,Fe,、,Cu,、,Zn,、,MoI,、,Se,等微量元素。,蛋白质平均含N量为16,这是凯氏（Kajedahl）定 氮法测蛋白质含量的理论依据.,蛋白质含量蛋白质含N量6.25,根据分子形状分类,球状蛋白质,纤维状蛋白质,结合,蛋白质,根据组成分类,活性蛋白质（如酶蛋白、转运蛋白、运动蛋白、,保护和防御蛋白、受体蛋白）,根据功能分类,非活性蛋白质（如硬蛋白、角蛋白）,蛋白质的分类：,简单蛋白质,简单蛋白质分类,结合蛋白质分类,(二）蛋白质分子的形状和大小：,纤维状蛋白：多数不溶于水和稀盐酸，少数如血纤维蛋白可溶,球状蛋白：可溶,膜蛋白：不溶于水，可溶于去污剂,蛋白质相对分子量变化很大，一般在6000-110,6,（肌联蛋白）,(三)蛋白质结构和功能的多样性,蛋白质序列的多样性决定了其功能的多样性。,如：20种氨基酸形成的二十肽（每种氨基酸只用1次）可以形成的异构体为：,20！=2,10,18,又如：相对分子质量为34000的蛋白质含12种氨基酸，假定在肽链的任一位置，12种氨基酸出现的概率相等，则34000/120=283,12,283,=10,305,1.催化：大多数酶是蛋白质。,2.调节：如激素和反式作用因子。,3.转运：如血红蛋白、血清蛋白、载酯蛋白、膜转运蛋白等。,4.贮存：如种子蛋白和卵清蛋白。,5.运动：如肌肉、微管蛋白等。,6.结构成分：如角蛋白、胶原蛋白等。,7.支架作用：如锚定蛋白、连接蛋白等。,8.防御和进攻：如抗体、毒蛋白等。,9.特殊功能：如甜蛋白、胶质蛋白等,蛋白质的主要功能：,二、肽,肽,(peptide)是氨基酸的线性聚合物，因此也称,肽链,（peptide chain)。蛋白质中氨基酸的基本连接方式是肽键(peptide bond)。,肽键,肽单位,(酰胺基、肽基),N端,C端,（一）肽和肽键的结构,共价主链,最简单的肽为二肽（dipeptide),含一个肽键；,一般把不多于12个残基的肽叫二肽、三肽十二肽；,不多于20个残基的肽叫寡肽(oligoteptide),多于20个残基的肽叫多肽；,氨基酸残基（amino acid residue).,共振产生的重要结果：,限制绕肽键的自由旋转,形成酰胺平面或肽（基）平面（amide/peptide plane）,产生键的平均化(键长：1.33 nm，,介于,1.25-1.45 nm之间,),肽键呈反式构型,共振杂化体,肽基的C、O和N原子间的共振相互作用,（二）肽的物理和化学性质,肽的晶体熔点高，说明是离子晶格；,肽至少有一个游离的氨基和游离的羧基，也是两性化合物，至少有2级解离，通常都有多级解离。因此，肽在水溶液中也能够带电，也有自己的等电点pI，其计算与测定同于氨基酸。,Glu-Gly-Ala-Lys,肽游离的,a,-氨基、,a,-羧基、R基团的化学反应与氨基酸类似；,双缩脲反应：（双缩脲相似于三肽，即2个肽键），与碱性硫酸铜溶液反应，生成紫红色化合物。,凡大于三肽的肽都能发生此反应，2肽不行。,（三）天然存在的活性肽,谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。,谷胱甘肽,基本策略：,片段重叠法氨基酸顺序直测法,基本步骤：,(1)测定蛋白质分子中多肽链数目；,(2),拆分蛋白质的多肽链，,断开多肽链内二硫键；,(3)分析每一条多肽链的氨基酸组成；,(4),鉴定多肽链N末端、C末端氨基酸残基；,(5)裂解多肽链成较小的片段；,(6)测定各肽段的氨基酸顺序；,(7)片段重叠法重建完整多肽链一级结构；,(8)确定半胱氨酸残基间形成二硫键交联桥的位置。,三、蛋白质（多肽）一级结构的测定,将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序,将肽段分离并测出顺序,专一性裂解,末端氨基酸测定,二硫键拆开,纯蛋白质,蛋白质顺序测定基本方法路线,N端：,Sanger法（二硝基氟苯反应）,DNS法（丹磺酰氯反应）,Edman法（苯异硫氰酸脂反应）,氨肽酶法,C端：,肼解法,还原法,羧肽酶法,多肽N、C-末端氨基酸的测定,Sanger法,N-,末,端,氨,基,酸,的,测,定,丹磺酰氯法,多肽,多肽,DNS-氨基酸,氨基酸混合物,+,-HCl,水解,N-,末,端,氨,基,酸,的,测,定,Edman,化学降解法,1.偶联反应,2.环化反应,ATZ（,噻唑啉酮苯胺）,少一个氨基酸残基的肽,N-,末,端,氨,基,酸,的,测,定,3.转化反应,PTH-氨基酸,（苯乙内酰硫尿氨基酸）,ATZ(,噻唑啉酮苯胺),N-,末,端,氨,基,酸,的,测,定,ABI protein sequencer,氨肽酶法,氨肽酶：从N端开始一个个水解肽键,氨肽酶（amino peptidase）：从N端开始一个个水解肽键;常用的异亮氨酸氨肽酶（Ieu amino peptidase）,N-末端氨基酸被封闭。,如：焦谷氨酰环化、乙酰化等。,焦谷氨酸氨肽酶处理。,N-,末,端,氨,基,酸,的,测,定,C-,末,端,氨,基,酸,的,测,定,肼解法,C-,末,端,氨,基,酸,的,测,定,羧肽酶法,羧肽酶A：Arg、Lys、Pro除外的氨基酸残基,羧肽酶B：仅Arg、Lys,羧肽酶C：除羟脯氨酸外的所有的氨基酸残基,羧肽酶Y：所有的氨基酸残基,二硫键的断裂,氨基酸组分的分析,氨基酸的薄层层析分析,（Phe.Tyr.Trp）,胰凝乳蛋白酶,（脂肪族）,弹性蛋白酶,羧肽酶,（Arg.Lys）,胰蛋白酶,氨肽酶,羧肽酶,胃蛋白酶,多肽链的部分裂解,酶法裂解,化学裂解,质谱法测定多肽氨基酸的序列,MALDI-TOF-MS,LC-ESI-MS/MS,片段重叠法确定肽段在多肽链中顺序示意,所得资料：,氨基末端残基 H,羧基末端残基 S,第一套肽段 第二套肽段,OUS,SEO,PS,WTOU,EOVE,VERL,RLA,APS,HOWT,HO,借助重叠肽确定肽段次序：,末端残基 H S,末端肽段,HOWT,APS,第一套肽段,HOWT,OUS,EOVE,RLA,PS,第二套肽段,HO,WTOU,SEO,VERL,APS,推断全顺序 HOWTOUSEOVERLAPS,Brown&Hartly Diagonal Electrophoresis,过甲酸熏蒸含磺基丙酸的肽段第二向电泳,多肽水解第一向电泳,基本要求,1.掌握蛋白质的分类和功能多样性；,2.掌握肽的结构特点和基本性质；,3.熟悉蛋白质一级结构的测定方法；,