体内药物分析 手性药物HPLC法

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第10章 手性药物的 高效液相色谱拆分法,空间结构不能重叠，互为镜像关系的立体异构体为对映体异构体，简称对映体（enantiomer），相应的药物称为手性药物。,第一节、概述,P 270,1,偏振光和比旋光度,光是一种电磁波，光波的振动方向与光的前进方向垂直。,如果让光通过一个象栅栏一样的 Nicol 棱镜 (起偏镜)就不是所有方向的光都能通过，而只有与棱镜晶轴方向平行的光才能通过。这样，透过棱晶的光就只能在一个方向上振动，象这种,只在一个平面上振动的光，称为平面偏振光，简称偏振光或偏光。,2,那么，偏振光能否透过第二个Nicol 棱镜 (检偏镜) 取决于两个棱镜的晶轴是否平行，平行则可透过；否则不能通过。如果在两个棱镜之间放一个盛液管，里面装入两种不同的物质：,3,结论：,物质有两类：,（1）旋光性物质能使偏振光振动面旋转的性质，叫做,旋光性；,具有旋光性的物质，叫做,旋光性物质。,（2）非旋光性物质不具有旋光性的物质，叫做,非旋光性物质。,旋光性物质使偏振光旋转的角度，称为,旋光度,，以,“,”,表示。,4,旋光仪,polarmeter,：,定量测量液体或溶液的旋光程度的仪器,在有机化学中，凡是手性分子都具有旋光性，而非手性分子则没有旋光性。,5,C*,不对称碳原子,不对称碳原子:,(,asymmetric carbon atom,),与,四个互不相同,的基,团相连的碳原子叫不,对称碳原子 C.,饱和碳原子具有,四面体结构,. (sp,3,杂化),6,具有镜像与实物关系的一对旋光异构体。,对映异构体,(,S,)-(+)-乳酸 (,R,)-(-)-乳酸 (,)-乳酸,mp 53,o,C mp 53,o,C mp 18,o,C,D,=+3.82,D,=-3.82,D,=0,p,K,a=3.79(25,o,C) p,K,a=3.83(25,o,C) p,K,a=3.86(25,o,C),15,15,15,外消旋乳酸,比旋光度,7,对映体的命名 RS命名原则,（1）按次序规则排出各取代基的顺序ABCD,原子序数大小规则序数大的原子优先,同位素规则原子量大优先,外推规则层层外推，先比较最大的,d. 相当规则重键看作多个单键如：C=C2 等,（2）方向盘法： 最小基团D放在操作杆上，,从D的对面看，顺时针为R,反时针为S.,药物分子的手性标记通常采用R/S序列标记法。,8,手性药物的现状,（现代药物分析选论，安登魁）,手性药物（579）,药物（1992）,天然和半合成药物（556）,合成药物（1436）,非手性药物（857）,单一异构体（73）,外消旋体（506）,手性药物（547）,非手性药物（9）,单一异构体（537）,外消旋体 （10）,9,同时，手性也是生物体系的基本特征。人体内糖的构型为D-构型，氨基酸为L-构型，因此，内源性的大分子物质如蛋白质、酶、载体、受体、糖蛋白、多糖、核酸等都具有手性特征。,手性药物的作用机制：,从立体化学角度看，手性药物的2个对映体实际上是2种完全不同的药物,。它们通过与体内大分子的不同立体结合，可产生不同的吸收、分布、代谢和排泄过程，从而导致,药物动力学参数,的变化。由于手性药物的两个对映体的体内药动学过程不同，而可能具有不同的药理和毒理作用，甚至药效拮抗，也可能其中一个对映体导致了药物不良反应。？,反应停不良反应？,(,S,)-thalidomide 致畸,10,手性药物的药理作用是通过与体内大分子之间的严格,手性匹配与分子识别,而实现的，也就是在人体内药物通过与具有特定物理形态的,受体,反应起作用。药物的两种立体异构体中，只有一种更适合与受体或活性部位结合，,从而抑制（或激动）该大分子的生理活性，达到治疗的目的。,药效,11,手性药物与生物体系相互作用具有立体选择性，可引起药理学差异，即,药理学立体选择性,。药理学立体选择性分为,药效学立体选择性,(stereoselectivity in pharmacodynamics)和,药代动力学立体选择性,(stereoselectivity in pharmacokine-tics)。,宫丽 综述,12,手性药物光学异构体的药理作用大致有以下5种类型：,一种光学异构体无治疗活性。,生物活性强度不同的光学异体。,生物活性强度相等的光学异构体。,生物活性类型不同的光学异构体。,生物活性相反的光学异构体。,13,反应停所引起的不良反应,14,(,S,)-thalidomide 致畸,(,R,)-thalidomide 镇静,FDA (U.S. Food & Drug Administration),To patent new drugs needs full documentation of the pharmacological profiles of the individual enantiomers as well as their combinations,.,1984年荷兰药理学家Ariens极力提倡手性药物以单一对映体上市，抨击以消旋体形式进行药理研究以及上市。他的一系列论述的发表，引起药物部门广泛的重视。,15,美国FDA 1992发布了手性药物指导原则。要求所有在美国上市的,消旋体类新药,，生产者均需提供报告，说明药物中所含的,对映体各自的药理作用、毒性和临床效果,。欧共体国家及日本、加拿大等国随后也规定了类似的法规。2006年1月，我国SFDA也出台了相应的政策法规。,这意味着化合物中如果存在一个手性中心，申请消旋药物时至少得做3组药理、临床数据，,无疑研究费用和工作量相应加大。如果开发的是光学纯的手性药，只需做一组试验即可。随着拆分技术和不对称合成技术的发展，选择光学纯药物开发要更合算一些。,16,自从1992年美国FDA开始要求手性药物以来，手性药物在研发的新药中所占比例逐年增加，据市场统计1993年单一对映体药物的销售额为350亿美元，2000年全球销售额达到1 330亿美元，预计2008年达到2 000亿美元。,手性药物以单纯对映体形式上市，可减少治疗总剂量，减少药物间相互作用，消除无活性对映体的毒性。,合成手性药物的方法主要有化学合成法和生物合成法两种。,17,上世纪60年代初，科学家们开始研究在极少量的手性催化剂作用下获得大量的单旋体，这就是手性合成技术。最初只获得了3%的收率，经过近三十年的努力终于获得了成功。目前最高的产率已经接近100%，特别需要指出的是这种技术可以使人们随心所欲地合成自然界中不存在的左旋体或右旋体,。,比如除草剂Metolachlor，其左旋体具有非常高的除草性能，而右旋体不仅没有除草作用，而且具有致突变作用，每年有2000多万吨投放市场，其中1000多万吨是环境污染物。Metolachlor自1997年起以单旋体上市，10年间少向环境投放约1亿吨化学废物。,18,因此，,若以消旋体药物给药,，在研究药物对映体的药效、毒性及药动学性质时，,应分别对单个光学异构体进行测定,。,如果采用传统、非立体选择性药物分析方法测定生物体液中药物对映体，以评价其药理行为，会得出不全面甚至错误的结论。,所有这些都要求建立高专属性、高灵敏度、高分离度的对映体拆分和测定方法。,19,对映体化合物之间除了偏振光的偏转方向不同外，其他理化性质完全相同，因而在非手性环境中基本无法分离。,创造手性环境，构造非对映异构体是实现手性拆分的基础,色谱法分离手性药物对映体的方法有：,间接法,直接法,手性固定相法 CSP,手性流动相法 CMP,创造手性环境,构造非对映异构体,20,第二节 手性分析的方法,一、间接法,又称柱前衍生化法，是药物对映体（不能说外消旋体）在用HPLC分离前，先与具有高光学纯度的手性衍生化试剂（CDR）反应，在药物对映体中引入第二个手性中心，形成非对映异构体，其理化性质就有较大的差异，因而可在普通固定相（非手性固定相）上实现分离,（R）SE +,(R) SA (R)SE(R) SA,(S) SA (R)SE(S) SA,21,1.衍生化反应注意事项：,（1）手性试剂必须是高光学纯度试剂，同时为了保证分析方法的准确性，衍生化反应需定量完成（90-100%）,（,2）手性待测物必需具有可反应的活泼基团如氨基、醇基、羧基，以保证与CDR反应完全。,（3）手性试剂及反应产物在化学上和手性上都要稳定,（4）所生成的非对映体在色谱分离时应有较高的柱效,（5）在选择手性衍生化试剂时，应同时考虑使生成的非对映异构体具有良好的检测特性，故手性试剂应具有紫外或荧光等可检测基团。,22,2.常用衍生化试剂的种类,（1）异硫氰酸酯（ITC）、异氰酸酯(IC)类 此类试剂易与大多数醇类和胺类化合物反应，形成相应的氨基甲酸酯或脲的非对映体。如麻黄碱类、肾上腺素类、肾上腺素拮抗剂、儿茶胺类等。,（2）萘衍生物类 其结构特征有利于提高立体选择性，同时此类化合物具有很强的紫外吸收，用UV检测器可大大提高检测灵敏度，因此，萘的衍生物用作CDR十分普遍。,23,（3）羧酸衍生物类 主要包括酰氯与磺酰氯类、酸酐类和率甲酸酯类。它们的手性碳位于羧基的位，可与胺、氨基酸及醇类药物反应生成非对映异构体衍生物。,（4）胺类 主要用于衍生化羧酸类、N-保护氨基酸、醇类药物,（5）测定体液中低浓度的药物对映体时，采用高灵敏度的,荧光,CDR,24,手性衍生化法的特点,优点,只需使用价格便宜、柱效较高的非手性柱,衍生化可提高灵敏度,缺点,需要柱前衍生化，操作复杂,衍生化试剂要求高的光学纯度,衍生化反应速率重现性较差,25,柱前衍生化-反相高效液相色谱法,拆分酮洛芬对映异构体,S,-(,)-酮洛芬,R,-(-)-酮洛芬,26,酮洛芬对映体的柱前衍生化示意图,S-萘乙胺,27,酮洛芬对映体的柱前衍生化方法,酮洛芬对照品溶液(1 mg/mL)0.1 mL,加入正己烷0.6 mL,二氯亚砜溶液,0.2 mL,75,1 h,冷却至室温,吹干后加入S-NEA溶液0.2 mL,5 min,振摇,加入2.0 mol/L H,2,SO,4,0.5 mL,混匀,吹干后溶解进样,二氯甲烷:乙醚,2,:,1,28,色谱条件,色谱柱：Hypersil C,18, 5,m, 150,5.0 mm ID，,流动相：乙腈水-乙酸-三乙胺(55 : 45 : 0.1 : 0.02，v/v)，,流速： 1 ml/min,检测波长：254 nm,29,酮洛芬对映体衍生化物色谱图,R,S,酮洛芬对映体衍生化物的保留时间为t,R,=7.3 min，t,R,=8.5 min，分离度为1.9,30,二、直接法,是在HPLC系统中引入“手性识别器”或手性环境，以形成暂时的非对映异构体复合物，根据其形成复合物的稳定系数不同而获得分离。,理论基础： Dalgliesh于1952年“三点相互作用”（three-point interaction)理论，在一对对映体和手性选择剂之间，,为了形成稳定性不同的非对映体分子络合物而达到手性分离的目的,，至少需要,三个分子之间的相互作用部位,，其作用力包括氢键相互作用包结络合作用-电荷转移相互作用立体契合作用过渡金属离子的手性配位相互作用。,31,提供手性环境，通过手性识别进行分离,32,（一）手性流动相法 CMP,在流动相加入手性添加剂（CMPA），使其与待测物形成非对映异构体复合物，根据其形成复合物的稳定常数的不同而得以分离。,直接法,常用的手性添加剂,环糊精添加剂,手性离子对试剂,配基交换型手性添加剂,33,1.环糊精添加剂,（一）手性流动相法 CMP,cyclodextrins，CD,可分为、三类，它们,分别由6，7，8个D-吡喃葡萄糖通过-1，4羟基连接。每个葡萄糖单元有5个手性碳原子,。,CD的手性识别主要来自环内腔对芳烃或脂肪烃侧链的包容作用及环外壳上的羟基与药物对映体发生氢键作用。,-CD及其改性CD因具有最佳大小的内腔，因而广为使用,34,2.手性离子对色谱法,（一）手性流动相法 CMP,是一类用于分离可解离对映体的离子对色谱法，已成功分离了-氨基醇类、氨基醇类、胺类等对映体化合物。,常用手性反离子有奎尼，奎尼丁、10-樟脑磺酸等。,3.配基交换型手性添加剂,在流动相缓冲溶液中加入金属离子和配位体交换剂形成二元络合物，药物对映体再与其形成稳定性不同的三元络合物而达到手性分离。,常用手性配基为光学活性氨基酸及其衍生物的二价金属离子螯合物。它们 和手性药物形成非对映异构配位络合物对。,35,特点,可采用普通的非手性固定相,不需对样品进行衍生化,手性添加物的可变范围较宽,36,-环糊精,手性流动相添加剂法拆分佐匹克隆对映体,徐颖 药学进展 2006 第9期,佐匹克隆（zopiclone）是第三代吡咯酮类速效催眠药,色谱柱：Zorbax Rx C18柱（ 4.6x,250,mm，5 m）；流动相为0.12mol/L的磷酸盐缓冲液-甲醇（7525，V/V），,其中含9 mmol/L 的-环糊精,；PH6.0，流速为0.8ml/min；检测波长305 nm；进样量20L；柱温为20。,37,手性固定相是在,色谱柱的担体,上加上,高光学纯度的手性异构体,制作而成。采用手性固定相的HPLC法可以直接、快速、有效、简便地分离,大多数,手性物质对映体。,直接法,（二）手性固定相法 CSP,目前，以商品出售的手性固定相有100种左右,但手性柱极其昂贵,38,1.电荷转移型手性固定相（小分子型）,手性固定相,是指分子中具有吸电子基团（如硝基）或斥电子基团（如氨基、烷基、烷氧基、萘环）并且能够与对映体发生电荷转移作用而达到拆分目的的一类手性固定相。,Pirkle 型手性固定相是目前使用量大、适用面广、对手性识别机理揭示较深的一类重要CSP。这类固定相研究主要贡献应归功于美国Illinois大学的Pirkle W H 研究组，故称Pirkle 型手性固定相,-碱型（有斥电子取代基）Pirkle 型手性固定相：拆分大量-酸的胺、氨基酸、亚砜类等对映体。,-酸型（有吸电子取代基）Pirkle 型手性固定相：拆分多种带烷基、醚基、氨基取代的芳香环类对映体。,39,常用的有：牛血清蛋白（BSA）和人血1-酸性糖蛋白(AGP)键合硅胶手性固定相,2. 蛋白质类手性固定相,手性固定相,蛋白质是一类高分子聚合物，所含,L-氨基酸具有手性特异性,，可与药物对映体在蛋白质结合位点进行手性识别而达到分离。此类键合相以,离子键或共价键,以及蛋白交联作用将蛋白质固定到硅胶上。,此类固定相的应用范围较广，拆分效果好，但其色谱柱,容量小,；常用的流动相为磷酸盐缓冲液pH4-7，离子强度为0-500mmol/L，,有机改性剂不得超过5%,。,40,手性固定相,3.多糖及其衍生物类手性固定相,每个葡萄糖单元含有,5个手性中心,，以及,一个伯羟基和2个仲羟基,，通过对其,化学改性,可以得到一系列衍生物。,多糖及其衍生物类手性固定相可细分为纤维素衍生物类、纤维素氨基甲酸酯类及直链淀粉类,此类固定相的优越之处在于：良好的稳定性，,制柱简单，无需键合,，适用于多种手性药物的拆分。,41,手性固定相,4.环糊精类手性固定相,将环糊精或其衍生物通过共价键键合到载体上便得到环糊精手性固定相,5.大环类抗生素手性固定相,大环类抗生素为多手性中心、多官能团的化合物，可通过多种属性识别机制进行识别，是一种高效的手性选择固定相。,大环抗生素具有疏水作用、偶极-偶极作用、-作用、氢键作用、和立体排阻作用，常用于手性拆分的大环抗生素主要有糖肽类、安莎霉素类、氨基糖苷抗生素,42,手性固定相,6.冠醚类手性固定相,冠醚与环糊精类似，是本身具有手性的低聚糖。冠醚类化合物有亲水性内腔和亲脂性外壳，可键合在硅胶或聚苯乙烯基质上制成手性固定相，与金属离子、氨基阳离子等形成主-客包容络合物是冠醚的重要特性。,冠醚毒性较大，有致癌性，与环糊精不同，不能作为手性流动相添加剂,43,AGP手性固定相分离6种药物对映体,尹燕杰 哈尔滨市食品药品检验检测中心,以-酸性糖蛋白为手性固定相对,15 种药物消旋体,进行了拆分研究，奈哌地尔等,6种药物对映体得到较好分离,，盐酸舍曲林和盐酸替罗非班对映体得到部分分离，,而其余7种药物未得到分离。,与常规柱不同，一种手性柱可能只能分离几种对映体,标准品，非血药浓度！,44,盐酸西替利嗪在人体内的立体选择性研究,徐亚杰,AGP色谱柱对手性药物选择性分离能力较强，但对不同结构的两个化合物分离能力不强，而且它具有寿命短、价格贵的特点，故很少有人直接用手性柱分离血浆样品中的对映体，大多采用非手性-手性色谱联用技术来克服以上的缺点，但操作要分为两步，因而在一定程度上增加了工作量。,先用C18色谱柱将西替利嗪与血浆内源性物质分离，然后收集色谱柱后西替利嗪消旋体色谱峰馏分，以AGP手性固定相柱将两种对映体完全拆分。,45,泮托拉唑对映体在大鼠体内的药物动力学研究,唐淑含 沈阳药科大学药学院,纤维素一三一（4-甲基苯甲酰酯）为手性固定相,泮托拉唑是一种选择性的长效质子泵抑制剂，可治疗胃溃疡、十二指肠溃疡等,药物分析杂志 2006,加样次数太多？,46,三类手性HPLC分离方法的比较,P276 表 9-1,47,实验,1.丙戊酸钠 -馒头峰-保护柱引起,2.标准曲线范围大时？,加权最小二乘法,分段,48,谢谢观看,/,欢迎下载,BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH,内容总结,第10章 手性药物的 高效液相色谱拆分法。结论： 物质有两类：。（1）旋光性物质能使偏振光振动面旋转的性质，叫做旋光性。具有旋光性的物质，叫做旋光性物质。外推规则层层外推，先比较最大的。从D的对面看，顺时针为R,反时针为S.。1984年荷兰药理学家Ariens极力提倡手性药物以单一对映体上市，抨击以消旋体形式进行药理研究以及上市。随着拆分技术和不对称合成技术的发展，选择光学纯药物开发要更合算一些。（3）手性试剂及反应产物在化学上和手性上都要稳定。-CD及其改性CD因具有最佳大小的内腔，因而广为使用。在流动相缓冲溶液中加入金属离子和配位体交换剂形成二元络合物，药物对映体再与其形成稳定性不同的三元络合物而达到手性分离。1.电荷转移型手性固定相（小分子型）。Pirkle 型手性固定相是目前使用量大、适用面广、对手性识别机理揭示较深的一类重要CSP。谢谢观看/欢迎下载,