NDDS-China-2012-生物制药注射剂的开发与确证-方伟杰课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,10/24/2012,0,生物制药注射剂的开发与确证,新型给药系统中国峰会,2012,2012.,10,.,24,方伟杰，博士,海正药业生物分析与制剂研究室主任,Email:,生物制药注射剂的开发与确证新型给药系统中国峰会2012,1,主要内容,生物制药的特性,生物制剂的开发的关键因素,物理、化学、生物学性质,物理、化学降解的作用机理及抑制,制剂分析方法的开发,制剂破坏条件的选择,辅料的选择和优化,海正药业生物制剂的开发实例：,HS016,总结,主要内容生物制药的特性,2,生物制药的特性,由重组技术制备的生物制品如蛋白质、单抗、疫苗等,结构,，组分,复杂,蛋白质,大分子（,5,-160,KDa,）,1,2,3,和,4,结构,复杂,混合物，如翻译后修饰等,特异性：每个生物药物有不同的性质，如分子量、溶解度、,pI,、亲水性、高级结构、生物学性质等,化学和物理降解,化学降解：涉及共价键的断裂和生成，比如脱酰胺化（,deamidation,），水解（,hydrolysis,），氧化（,oxidation,）,物理降解：不涉及共价键的断裂和生成，主要是高级结构的变化，包括吸附，变性（去折叠），聚集和沉淀,生物制药的特性由重组技术制备的生物制品如蛋白质、单抗、疫苗等,3,生物制药的特性（二）,免疫原性,Immunogenicity,所有生物制药都有潜在的免疫原性！,免疫反应的频率很多因素有关：氨基酸序列、质量（如多聚体、糖基化）、病人状况、给药频率、途径,产生的后果差异很大：安全性（如过敏反应），疗效（如产生中和抗体,neutralization antibody,），代谢等,生物制药的特性（二）免疫原性Immunogenicity,4,影响生物制药稳定性的,因,素,生物分子的结构（氨基酸序列、翻译后修饰，分子内与分子间作用力）,制剂，如蛋白浓度，,pH,，辅料等,生产设施、工艺,/,过程,原材料，如辅料、包材的质量等,影响生物制药稳定性的因素 生物分子的结构（氨基酸序列、翻译,5,如何确定生物制剂？,了解生物药物的目标产品性质（,Target Product Profile,，,TPP,）,了解物理、化学、生物学性质及降解机理,开发有效的分析及稳定性检测方法,鉴别出主要的降解条件,运用筛选（,screening,）和实验设计（,DOE,）的原理来评估制剂因素及它们之间的相互作用,鉴别出候选制剂进行全方位的研究并最终确定,如何确定生物制剂？了解生物药物的目标产品性质（Target,6,目标产品性质（,TPP,）,给药途径（静脉，皮下，肌肉）,剂型（水针、冻干）,单次或者多次使用,(single-/multiple-dose),生物药物的浓度,治疗指数、安全性大小,给药的频率，是否需要在医院使用,市场竞争的情况，新制剂的优点,目标产品性质（TPP）给药途径（静脉，皮下，肌肉）,7,生物药物的物理、化学性质,物理、化学性质可以通过软件进行初步估算,Mw,、溶解度、,pI,、,EC280,、,hydrophobicity,、高级结构等,以往的经验（如文献、其他类似分子等）,物理、化学性质需要通过分析进行确认,确认上述基本信息,热稳定性（,T,m,，,T,agg,等）,多聚体,翻译后修饰（,PTM,）如糖基化，脱酰胺化等,生物药物的物理、化学性质物理、化学性质可以通过软件进行初步估,8,化学降解,-,脱酰胺化,Deamidation,天冬氨酸,异天冬氨酸,天冬酰胺,琥珀酰亚胺,化学降解-脱酰胺化Deamidation天冬氨酸异天冬氨酸天,9,化学降解,-,水解,Hydrolysis,酸性裂解,Acidic cleavage(Asp-Pro),抗体,Hinge,部位裂解,抑制脱酰胺化和水解反应的方法,冻,干,优化,pH,，缓冲液种类和浓度,增加物理,/,构象,稳定性,化学降解-水解 Hydrolysis酸性裂解 Acidic,10,化学降解,-,氧化,Oxidation,主要在,Met,、,Cys,和芳香基氨基酸上，比如,Tyr,，,Trp,三大类型,金属离子催化氧化反应,自由基氧化反应,光催化氧化反应,抑制氧化反应方法,螯合剂（如,EDTA,）,自由基清除剂,/,抗氧化剂,(,如,Met and Trp),避光保存,排除氧气,增加物理稳定性,化学降解-氧化 Oxidation主要在Met、Cys和芳香,11,化学降解,-,其他类型,N-,端环化如,pGlu,和,DKP,反应,消旋化和,消除反应（,r,acimization,，,-,elimination,）,还原性糖基化（,glycation,）,二硫键错配（,disulfide scrambling,）,化学降解-其他类型N-端环化如pGlu和DKP反应,12,化学性质分析方法,化学性质,/,降解,途径,分析方法,分子量,凝胶电泳（,SDS-PAGE,），,质谱（,MS,）,氨基酸,序列,Edman,降解,LC-MS,纯度,凝胶电泳（,SDS-PAGE,），反相色谱（,RPC,），,分子排阻色谱（,SEC,）,，,离子交换色谱（,IEC,），毛细管电泳（,CE,）,电性分布及变化,等点聚焦（,IEF,）,，,IEC,CE,脱酰胺化反应,IEC,，,RPC,（多肽,），,LC-MS,水裂解反应,RPC,，,SDS-PAGE,，,LC-MS,氧化反应,RPC,，肽图,，,LC-MS,共价键结合多聚体,SDS-PAGE,，,MS,化学性质分析方法化学性质/降解途径分析方法分子量凝胶电泳（S,13,物理降解：吸附在表面,造成蛋白剂量的损失和构型的改变,液,-,固表面：,吸附到包材的容器壁、胶塞,液相柱子、过滤器,冰,-,水表面,外来异物，包材的渗出物等,液,-,气表面,容器的空气（,headspace,），震荡、搅拌时与空气的接触,物理降解：吸附在表面造成蛋白剂量的损失和构型的改变,14,物理降解：变性,/,去折叠,二级等高级结构的变化,维持天然结构的重要性,天然构象是保持生物学活性的基础,变性蛋白更容易造成毒副作用如免疫原性,变性以后容易发生聚集等后续反应,生物药物构象不稳定性的根源,变性所需要的能量很低,(30kcal/mol),物理降解：变性/去折叠 二级等高级结构的变化,15,物理降解：聚集,Aggregation,蛋白质分子通过相互作用聚集在一起,蛋白变性（构象改变）,相互吸附（胶体不稳定性）,分类,可逆,/,不可逆聚集（,reversible/irreversible,）,类似天然构象的聚集,/,完全变性的聚集（,native-like,？）,共价结合,/,非共价结合聚集,covalent/non-covalent,可溶性,/,不溶性聚集,s,oluble/insoluble(precipitation),物理降解：聚集Aggregation蛋白质分子通过相互作用聚,16,可见与不可见微粒,Visible and sub-visible particles,微粒的危害,免,疫反应！死亡，,产生,中和抗体,堵塞血管，降低,疗效，,毒性,微,粒的分类,外源性,/,非蛋白,微粒,蛋白聚集,微粒,微粒无处不在，每一步,操作,都会产生,/,带入微粒！,微,粒的检测,肉眼外观检测,光阻法,(Light obscuration,）,Micro-Flow,Imaging,（,MFI,），,Coulter counter,动态光散射（,DLS,），,Nanosight,，,Affinity,Biosensor,，,TEM,Carpenter,et al.,J Pharm Sci,2009,27,1201,可见与不可见微粒Visible and sub-visib,17,物理稳定性影响因素,加热,pH,盐,（疏水）表面,震荡,剪切力,光照,冻融,化学试剂,(,金属离子,表面活性剂,防腐剂,有机溶剂等,),物理稳定性影响因素加热,18,物理稳定性分析方法,物理性质,分析方法,热稳定性,T,m,：,DSC,，圆二色光谱（,CD,）,/,荧光,T,agg,：,DLS,构象改变,二级,：远紫外圆二色光谱（,Far-UV CD,），红外（,IR,）,三级,：,近,紫外圆二色光谱（,Near,-UV,CD,），荧光（,F,luorescence,），,2D-UV,，,NMR,，,X-ray,可溶性聚集,SEC,，,MALS-SEC,，超高速离心仪（,AUC,）,不溶性聚集（,微粒,）,肉眼，光阻法，,MFI,，,DLS,物理稳定性分析方法物理性质分析方法热稳定性Tm：DSC，圆,19,增加物理稳定性的方法,增加蛋白质的天然,构象,稳定性,加入“选择性排除（,preferentially excluded,）”的辅料，如糖类，氨基酸，,PEG,等,加入与天然构象结合的配体,增加蛋白溶液的胶体稳定性，如改变其表面的电性分布,加入表面活性剂如吐温,20,或,80,与蛋白竞争表面吸附,抑制蛋白,-,蛋白疏水基团的相互作用,增加物理稳定性的方法增加蛋白质的天然构象稳定性,20,生物制剂开发的降解条件,加热（,25-40C,，小于,T,m,10C,以上）,冻融（,Freeze-Thaw,）,光照（,Photo-degradation,）,震荡（,Agitation,）,生物制剂开发的降解条件加热（25-40C，小于Tm 10,21,辅料的筛选,原则：每个辅料及使用的量都要有明确被证明的作用！,缓冲液，如磷酸、柠檬酸、组氨酸缓冲液,表面活性剂，如吐温,20,或,80,结构保护剂，如糖类，氨基酸，,PEG,等,等渗剂，如氯化钠,抗氧化剂，如,EDTA,，蛋氨酸,配体，如金属离子,赋形剂，如甘氨酸、甘露醇,防腐剂，如苯甲醇,辅料的筛选原则：每个辅料及使用的量都要有明确被证明的作用！,22,海正生物制剂研发实例,-HS016,重组全人源化单克隆抗体,治疗人类自身免疫疾病,原研药在国际上的年销售,50,亿美元,国内还未有仿制药上市,水剂、预灌封注射器,海正生物制剂研发实例-HS016重组全人源化单克隆抗体,23,制剂前研究（,Preformulation,）,原液储存方法：冷冻（,-80C,）,VS,低温（,5C,）,原液冻（,-80C,）、融（室温）,6,次不影响质量,低温保存条件下有大量的多聚物产生,pH,和盐浓度的影响,最佳,pH,约为,5.2-6.0,左右,盐（,NaCl,）在原处方中只起到等渗剂的作用,强氧化（,H,2,O,2,）的影响,强氧化剂不会对蛋白产生明显的破坏：不需加入抗氧化剂或螯合剂,制剂前研究（Preformulation）原液储存方法：冷冻,24,制剂的优化和确认,根据原研制剂和处方前的研究数据为基础,常见保护剂的影响：多糖、氨基酸、多元醇,热稳定性：,DSC,、,DLS,强降解条件,高温、冻融、震荡、光照,降解产物分析,纯度：,SEC,，,SDS-PAGE,不溶性微粒：肉眼外观、光阻法、,MFI,生物学活性,制剂的优化和确认根据原研制剂和处方前的研究数据为基础,25,原、新制剂热稳定性比较,-T,m,DSC,用于比较融化温度（,T,m,）的差异,处方,T,m1,（,o,C,）,T,m2,（,o,C,）,T,m3,（,o,C,）,原制剂,74.20,80.96,86.14,新制剂,75.23,81.73,87.09,融化温度,T,m,是指,50%,分子发生变性的温度，有三个数值说明有三个主要变化区域,原、新制剂热稳定性比较-TmDSC用于比较融化温度（Tm）的,26,原、新制剂热稳定性比较,-T,agg,DLS,比较开始发生明显聚集的温度（,T,agg,）,原、新制剂热稳定性比较-TaggDLS比较开始发生明显聚集的,27,高温加速稳定性（,40C,2W,）：,1,、,