获能和顶体反应优选ppt资料

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,获能和顶体反应,第一页，共49页。,2,精子获能、顶体反应和与透明(tumng)带的结合,曾海涛(hi to),中南大学生物科学与技术学院,第二页，共49页。,3,国家中长期科学和技术发展规划纲要（2006-2020）,六、基础研究,4.重大科学研究计划,（4）发育(fy)与生殖研究,第三页，共49页。,4,第四页，共49页。,5,一.精子获能,哺乳动物精子在离开雄性生殖道时，还不能立即与卵子受精。它必须在雌性生殖道内经历一段成熟过程，才获得受精能力(nngl)。这一现象称为获能（1951年张民觉和Austin）。,第五页，共49页。,6,体外获能,体内获能的研究常受到某些条件的限制。从雌性生殖道内特别是输卵管内回收到的精子数量太少，不易(b y)检测获能精子化学成分的改变。因此,研究精子获能一般采用体外获能的方法。,第六页，共49页。,7,第七页，共49页。,8,影响(yngxing)获能的一些因素(温度、pH、渗透压),大多数动物精子体外获能的温度为3738。有的动物(猪和羊)精子获能的最佳温度为39。,第八页，共49页。,9,获能的最适pH为7.4 8.0。低于6.7时获能时间大大(d d)延长；豚鼠精子pH低于7.6时则获能时间需24 h。pH高于8.2时，可缩短精子获能时间，但不利于精子生存。,第九页，共49页。,10,渗透压对精子获能也产生重要影响。低于270 mOsmkg H2O 或高于343 mOsmkg H2O 则影响精子获能进程(jnchng)。最适宜的渗透压为295310 mOsmkgH2O,第十页，共49页。,11,获能的种间和种内差异,体外获能所需要的时间(shjin)，种间存在着较大差异。在一些种类动物获能最短时间(shjin)为0.5-1h如小鼠；另一些种类生物则需要78h，如兔及人。,第十一页，共49页。,12,精子获能的异质性,从同一个体射出的所有精子并不是同时(tngsh)发生获能。一些精子获能较快，另一些则较慢，即所谓获能上的“异质性”或非均一性。,第十二页，共49页。,13,精子获能的可逆性,张民觉(1958)最早发现精子获能是一个可逆过程，获能精子一旦与精浆和附睾液接触，又可去获能(decapcitation)。如果把去获能的精子转移到雌性生殖道中，并使之停留一段时间，精于又可重新获能。表明精浆和附睾液中存在着一种(y zhn)去获能因子(decapcitation factor，DF)。如用超速离心除去DF，精子也可重新获得受精能力。表明DF参与获能的调节。一般认为DF是一种(y zhn)糖蛋白。,第十三页，共49页。,14,获能期间精子出现的各种变化,1.胆固醇是维持细胞正常结构和功能(gngnng)所必需的成分。质膜脂质双层内有丰富的胆固醇。获能期间精子质膜胆固醇外流。精子质膜胆固醇的丧失可使膜蛋白的分布发生改变;可使膜的通透性发生改变,进而促进获能。,第十四页，共49页。,15,人输卵管液中含有的白蛋白(HSA)，能结合并移去胆固醇；输卵管液高浓度的高密度脂蛋白(HDL)可直接诱导胆固醇外流，其作用比白蛋白更强.在精子(jngz)体外获能时，获能液中的牛血清白蛋白(BSA)，在有HCO3-存在时可与胆固醇结合，以浓度依赖方式刺激胆固醇外流。,第十五页，共49页。,Hoechst 33258法,它可根据精子不同的获能和AR阶段(jidun)或精子表面差异进行染色。,卵子ZP蛋白作为精子受体，与精子上相应的配体(即透明带结合蛋白)相互作用精子表面的卵子结合蛋白分为初级透明带结合蛋白和次级透明带结合蛋白。,第四十五页，共49页。,获能期间精子出现的各种变化,获能期间精子质膜胆固醇外流。,精子一旦获能,其运动类型发生显著改变,精子头部侧摆幅度和频率明显增加,而尾部振幅加大,频率加快,呈现一种(y zhn)特殊的超激活运动或鞭打样运动(whiplash motility)。,这一现象称为获能（1951年张民觉和Austin）。,第四十四页，共49页。,第二十八页，共49页。,从同一个体射出的所有精子并不是同时(tngsh)发生获能。,它必须在雌性生殖道内经历一段成熟过程，才获得受精能力(nngl)。,表明精浆和附睾液中存在着一种(y zhn)去获能因子(decapcitation factor，DF)。,HCO3-浓度增加.,体外获能所需要的时间(shjin)，种间存在着较大差异。,另一些种类生物则需要78h，如兔及人。,16,获能期间精子出现的各种(zhn)变化,2.胞内离子的改变,精子获能期间一些胞外Ca2+进入胞内，胞内Ca2+逐步升高，并呈时间依赖关系.HCO3-浓度增加.Ca2+和HCO3-均能刺激腺苷酸环化酶(AC)合成cAMP，胞内cAMP升高进而促进精子获能.,第十六页，共49页。,17,3.,活性氧,第十七页，共49页。,18,4.,磷酸化,第十八页，共49页。,第十九页，共49页。,第二十页，共49页。,21,检测精子获能的方法,超激活运动(yndng),顶体反应,精子穿卵试验(SPA),CTC法,第二十一页，共49页。,22,超激活运动(hyperactivated motility,HAM),精子一旦获能,其运动类型发生显著改变,精子头部侧摆幅度和频率明显增加,而尾部振幅加大,频率加快,呈现一种(y zhn)特殊的超激活运动或鞭打样运动(whiplash motility)。HAM系受精前精子为了适应受精需要而发生的一类特殊的运动类型。Yanagimachi(1970)首先在仓鼠精子获能时观察到这种现象。,HAM对于精子穿越输卵管峡部,克服输卵管上皮细胞的阻力,最后穿过卵丘细胞及其细胞外基质和透明带起着重要的作用。,第二十二页，共49页。,23,顶体反应(acrosome reaction,AR),获能后的精子在生理性诱导物如透明带、孕酮,或非生理性诱导物如钙离子载体A23187的诱导下,可发生顶体反应,即精子质膜与顶体外膜融合(rngh)释放顶体内容物。,第二十三页，共49页。,24,第二十四页，共49页。,25,第二十五页，共49页。,第二十六页，共49页。,考马氏亮蓝染色法,第二十七页，共49页。,28,精子穿卵试验(sperm penetration of zona-free hamster egg assay),将除去了透明(tumng)带的仓鼠卵子与获能处理后的精子混合培养,观察穿入卵子的精子数目.,第二十八页，共49页。,29,CTC(chlortetracycline)法,CTC是一种抗菌素即金霉索。它可根据精子不同的获能和AR阶段(jidun)或精子表面差异进行染色。它可将精子分为3种类型，即F、B和AR型。,第二十九页，共49页。,30,二.顶体反应,当获能的精子接近或进入卵丘细胞或与卵透明(tumng)带结合时被激活，其头部发生顶体反应或称胞吐作用(exocytosis)。顶体反应使精子顶体内所含的顶体酶释放出来，支持精子穿过卵透明(tumng)带，从而导致精卵融合即受精。,第三十页，共49页。,31,AR时细胞内Ca2+浓度的增加,Ca2+在AR过程中起着关键的作用,大多数诱导剂诱导精子发生AR时,Ca2+内流是早期(zoq)的反应之一.,第三十一页，共49页。,32,第三十二页，共49页。,33,检测顶体反应的方法(fngf),电镜法,相差显微镜法,CTC法,Hoechst 33258法,考马氏亮蓝染色法,第三十三页，共49页。,34,电镜法,第三十四页，共49页。,35,相差显微镜法,该法适用(shyng)于观察顶体较大的动物精子,如豚鼠,仓鼠,麝.,顶体较小的精子不能用该法观察.,如小鼠,大鼠,兔.,第三十五页，共49页。,36,第三十六页，共49页。,37,Hoechst 33258法,Hoechst 33258是一种可结合DNA的荧光染料.,精子先在含Hoechst 33258的培养基中预培养。只有死精子的核才能吸取这种染料，而具有完整质膜的活精子则不能吸收(xshu)。然后固定精子，再以亲顶体的凝集素染色或用抗顶体内含物的抗体染色。,第三十七页，共49页。,38,三.精子与透明带的识别(shbi)和结合,透明带是一层包被在卵外的糖蛋白.人、兔、大鼠和小鼠透明带都由ZP1、ZP2和ZP3三种成分组成。,第三十八页，共49页。,39,ZP2和ZP3以异二聚体的形式存在，排列成细丝(x s)状，细丝(x s)间由ZP1连接,第三十九页，共49页。,40,精子与卵子ZP之间的初级(chj)识别是由ZP3和精子质膜上的ZP3受体介导的；精子与ZP3结合诱发顶体反应的发生；发生了顶体反应的精子与ZP2相互作用，发生次级识别和结合。,第四十页，共49页。,41,第四十一页，共49页。,42,精子与卵子透明带的初级识别和结合ZP3的作用,有许多(xdu)证据表明，ZP3是精子的初级受体。证据包括：,纯化的mZP3仅能与顶体完整的精子头部质膜结合；,精子能与共价附着mZP3的玻璃珠结合，也能与转入mZP3基因后能够分泌mZP3的畸胎瘤细胞结合；,纯化的mZP3能诱发精子顶体反应；,抗ZP3多肽的抗体能阻止精卵结合；,第四十二页，共49页。,43,精子与透明带的次级识别和结合ZP2的作用,顶体反应发生后，精子质膜脱落，精子表面与ZP3结合的受体也随之丢失。此时，精子与ZP间发生次级识别。ZP中负责与精子发生次级识别的是ZP2。mZP2能与顶体反应后的精子结合。mZP2的抗体能抑制顶体反应后的精子与ZP的次级结合，而对顶体反应前顶体完整的精子与ZP间初级(chj)识别和结合没有影响,第四十三页，共49页。,44,ZP1的作用,小鼠卵子的ZPl主要发挥结构支撑功能，它把ZP2、ZP3细丝横向连接起来，构成透明带三维构象。然而，在其他动物，例如猪和兔的研究表明，ZPl也可能(knng)是精子的次级受体，在精卵结合中发挥作用。,第四十四页，共49页。,45,精子表面的透明带结合蛋白,卵子ZP蛋白作为精子受体，与精子上相应的配体(即透明带结合蛋白)相互作用精子表面的卵子结合蛋白分为初级透明带结合蛋白和次级透明带结合蛋白。,初级透明带结合蛋白位于精子顶体区质膜上。它与ZP3相互作用，诱发顶体反应的发生。次级透明带结合蛋白位于顶体反应后的精子表面，即顶体内膜上，它与ZP2相互作用，在精子穿过ZP过程中，次级透明带结合蛋白始终使精子与ZP结合。,不同动物中，已有多种不同的精子蛋白被认为参与(cny)精卵识别和结合。,第四十五页，共49页。,46,半乳糖苷转移酶(GalTase),B-l，4半乳糖苷转移酶是最早报道的初级卵子结合蛋白，它存在精子表面。纯化的GalTase及其抑制剂和它的抗体均可抑制精卵相互作用。该酶可特异(ty)地作用于ZP3。,实验证据表明，GalTase可能是精子上的初级卵子结合蛋白。然而，来自GalTase基因敲除小鼠的精子在体内仍具有受精能力。,第四十六页，共49页。,47,透明带受体激酶 p95,另一个初级卵子结合蛋白候选者是一种跨膜受体，具有酪氨酸激酶活性，称为透明带受体激酶(zona receptor kinase,ZRK)，又称p95。酪氨酸磷酸化是精子受精所必需(bx)的，抑制酪氨酸蛋白激酶活性即可阻止顶体反应，从而阻断受精。小鼠和人的精子中都有一种95 kDa的酪氪酸磷酸化的蛋白质.,第四十七页，共49页。,48,sp56,sp56是小鼠精子表面的一种分子量为56 kDa的外周膜蛋白。它仅存在于顶体完整(