内酰胺酶的分类及检测

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,-,内酰胺酶的分类及检测,表,2 -,内酰胺酶的结构和功能分类,分子结构 功能 举例 最适底物 抑制剂,(Ambler)(Bush)PEN CARB OX CR CTX ATM IPM CLAV CLOX EDTA,丝氨酸酶,A 2a PC1,，,LEN-1,卅 十 土 卄 ,2b SHV-1,TEM-1,卅 十 十 卄 卄 ,2be K1,TEM-3,卅 十 十 卄 卄 卄 卄 ,SHV-2,PER-1,2br TEM-31,卅 十 十 十 ,2C PSE-1,BRO-1,卄 卅 十 十 十 ,2e,卄 卄 卄 卄 卄 卄 ,2f Sme-1,NMC-A,卄 十,?,十 十 卄 卄 十 ,IMI-1,C 1 AmpC,卄 十 卅 十 卄 ,D 2d OXA-1,卄 十 卅 十 ,V,未定,4 AVS-1,卄 卄 卄,V V,金属酶,B 3 IMP-1,卄 卄 卄 卄 卄 卄 卄,嗜麦芽,L-1,Bush-J-M,分类策略,3,组金属酶,头孢菌素酶,1,组,酶,EDTA 2e,组,2a,组,2d,组,青霉素 酶,2c,组,2f,组,非金属酶,4,组,2be,组,广谱酶,2b,2br,组,小结,1,组酶：头孢菌酶，优先水解底物是头孢菌素，它们水解青霉素的的速率低于水解头孢噻啶的速率的,30%,，对三代头孢菌素和头霉烯耐药，但对碳青酶烯和四代头孢菌素较为敏感，对酶抑制剂克拉维酸和,EDTA,均不敏感，可被氯唑西林抑制,2,组酶：优先水解青霉素类抗生素，其中水解头孢噻啶的速率低于水解青霉素的速率的,30%,者为青霉素酶，又分为,2a,、,2b,、,2c,、,2d,、,2e,和,2 f,亚组。,3,组酶：又称金属酶，能灭活青霉素类、头孢菌素类和碳青酶烯类抗生素，但对安曲南敏感；酶活性可被,EDTA,抑制，但酶抑制剂克拉维酸和氯唑西林对它无作用。,4,组酶：是染色体介导的耐抑制剂的青霉素酶，对头孢类抗生素的敏感性不定，对氨曲南和碳青霉烯敏感。,A,类,-,内酰胺酶,1,。,A,类,-,内酰胺酶：,广谱酶,2b,组,A,B,A,大肠埃希菌,TEM-1,型酶结构；,B,肺炎克雷伯菌的,SHV-1,型酶结构,超广谱,-,内酰胺酶,(2be),经典超广谱,-,内酰胺酶,TEM,型,ESBLs,SHV,型,ESBLs,SHV-2,型,ESBLs,、,SHV-5,型,ESBLs,SHV,环突变型,ESBLs,其他超广谱,-,内酰胺酶,CTX-M-,型酶,可为分,4,个小组,PER-1,及其相关,ESBL,PER-1,、,-2,、,VEB-1,、,2,CME-1 TLA-1,特殊的非典型,ESBL,SFO-1,、,GES-1,TEM,型,ESBLs,1,Glu,140,Lys,和,Glu,240,Lys,替换：对头孢他啶和氨曲南 耐药,2,Arg,164,Ser,或,His,：对头孢他啶耐药，对头孢噻肟敏感,3,Gly,238,Ser,：主要提高了对头孢噻肟的水解能力（如,TEM-19),SHV,型,ESBLs,1.SHV-2,型,ESBLs,：,Gly,238,Ser,，主要提高水解头孢噻肟的能力,2.SHV-5,型,ESBLs,：同时具有,Gly238Ser,和,Glu240Lys,突变,3.SHV,环突变型,ESBLs,：,Asp179Ala,、,Arg,A,类,-,内酰胺酶与,B,类、,C,类和,D,类酶的同源性比较,B,类,-,内酰胺酶,又称金属,-,内酰胺酶，,Bush,功能分类中属于,3,组酶，能灭活青霉素类、头孢菌素类和碳青酶烯类抗生素，但对安曲南敏感；酶活性可被,EDTA,抑制，但酶抑制剂克拉维酸和氯唑西林对它无作用。,金属酶的功能亚分类：,3a,、,3b,、,3c,金属酶的分子生物学亚型分类,:B1,、,B2,、,B3,亚分类 物学亚类 酶的型别 宿主 发现国家 发现时间 分子量 等电点,3a B1 CcrA3,脆弱拟杆菌 美国,1994 26,未测,3a B1 CcrA4,脆弱拟杆菌 美国,1994 26,未测,3a B1 CcrA,脆弱拟杆菌 美国,1986 26 5.2,3a B1 PCM-1,洋葱假单胞菌 未知,1994,未测,8.5,3a B1 IMP-1,铜绿假单胞菌 日本,1991 28 9.0,3a B1 IMP-2,不动杆菌属 意大利,1999 26 8.1,3a B1 IMP-3,铜绿假单胞菌 日本,2000,3a B1 IMP-4,不动杆菌属 香港,2001 8.0,杨氏枸橼酸杆菌 中国,2001,未测 未测,3a B1 IMP-6,粘质沙雷菌 日本,2001,未测 未测,3a B1 IMP-7,铜绿假单胞菌 加拿大,2002,3a B1 IMP-8,肺炎克雷伯菌 中国台湾,2001,未测,8.2,3a B1 VIM-1,铜绿假单胞菌 意大利,1999 5.3,3a B1 VIM-2,铜绿假单胞菌 法国,2000,未测 未测,3a B1 VIM-3,铜绿假单胞菌 台湾,2000,未测,5.1,3b B2 CphA,嗜水气单胞菌 意大利,1993 28 8.0,3b B2 A2h,嗜水气单胞菌 美国,1990 28 8.0,3b B2 ACP,嗜水气单胞菌 苏格兰,1996 31 8.2,3b B2 AsbM1,简达气单胞菌 美国,1990 34 9.1,3b B2 AsA-1,杀蛙气单胞菌 苏格兰,1994 19 7.9,3b B2 Imis,温和气单胞菌 英国,1995,未测,9.,3c B2,戈氏军团菌,1986 25 10.5,3a B3 L1,嗜麦芽窄食单胞菌 日本,1982 118 6.9,B,类,-,内酰胺酶,金属酶的三维结构图,A,：,CcrA,（脆弱拟杆菌）,B,：,Bc,（蜡样芽胞杆菌）,C,：,L1,（嗜麦芽窄食单胞菌）,园柱代表,螺旋，板片代表,片层 绿色数字为,His,残基，兰灰色数字为,Asp,残基，橙色数字为,Cys,或,Ser,残基。,A,B,C,获得性金属酶,（,1,）,IMP,型金属酶,（,2,）,VIM,型金属酶,-,内酰胺酶的检测,1,酶蛋白性质分析：包括表型分析和酶动力学分析。,2,基因分析：基因型别分类、测序、分析其结构基因和调控,基因。,3,转移性分析：分析酶编码基因位于质粒上还是染色体上；,在不在整合子中。,收集菌株,耐药表型分析（纸片药敏试验和,E-,试验分析）,提取酶粗制品进行三相水解试验、等电聚焦电泳和酶动力学分析,根据结果判定酶的类群，选择相应,PCR,引物扩增,阳性 阴性,整合子,PCR,初筛,阳性 阴性,鸟枪法克隆可表达,-,内酰胺酶基因,测定,PCR,产物序列,PCR,扩增全 测定全克隆片段,可变区并测序 序列,整合子检查 提取质粒接合实验 克隆并转化到,DH5,表达,-,内酰胺酶,阳性 阴性,钙转或,MgCl2,或电转化,（,2,）耐药表型分析：纸片药敏试验和,E-,试验测定,MICs,（,3,）酶性质分析：提取酶粗提物进行,a.,三相水解试验。,b.,等电聚焦电泳。,C.,酶动力学分析。,（,4,）基因分析：,a.PCR,扩增及,PCR,产物测序。,b.PCR,扩增整合子全可变区，分析其中结构和可能的,-,内酰胺酶基因。,C.,鸟枪法克隆可表达的,-,内酰胺酶基因，分析基因结构。,（,4,）转移性分析：,A,。,质粒：,a.,质粒接合试验。,b.,转化试验：电转化、钙转化或,MgCl,2,转化,B,。整合子：,a.PCR,扩增整合子全可变区及,PCR,产物序列测定。,ESBLs,和,AmpC-,内酰胺酶的检测,一、,ESBLs,的检测,1,纸片法：,表,1,肺克、催娩克雷伯、大肠埃希菌,ESBLs,产株纸片法初筛和确证实验,2,MIC,法：,表,2,肺克、催娩克雷伯、大肠埃希菌,ESBLs,产株,MIC,法初筛和确证实验,验方法 初筛试验 表型确证试验,培养基,MH MH,抗菌药物浓度 头孢泊肟,10g,或 头孢他啶,30g,头孢他啶,30g,或 头孢他啶,/,克拉维酸,30/10g,氨曲南,30g,或 和,头孢噻肟,30g,或 头孢噻肟,30g,头孢曲松,30g,头孢噻肟,/,克拉维酸,30/10g,（同时用多于一种抗生素可提高试验灵敏度）（确证试验要求同时做上述四种纸片）,孵育条件 同标准纸片扩散法 同标准纸片扩散法,结果 头孢泊肟抑菌圈 ,22mm,有一种抗生素出现加有克拉维酸纸片抑菌圈,头孢他啶抑菌圈 ,22mm,没有加克拉维酸纸片抑菌圈,5 mm=,产,ESBL,氨曲南抑菌圈 ,27mm,头孢噻肟抑菌圈 ,27mm,头孢曲松抑菌圈 ,25mm,=,可疑产,ESBL,质量控制 阴性对照,ATCC25922,阴 性对照,ATCC25922,加有克拉维酸,（参考质控标准）没有加克拉维酸抑菌圈,2mm,阳性对照,ATCC700603,头孢泊肟抑菌圈,9-16mm,头孢他啶,/,克拉维酸抑菌圈,头孢他啶抑菌圈,10-18mm ,头孢他啶抑菌圈,5 mm,氨曲南抑菌圈,9-17mm,头孢噻肟抑菌圈,17-25mm,头孢噻肟,/,克拉维酸抑菌圈,头孢曲松抑菌圈,16-24mm ,头孢噻肟抑菌圈,3 mm,验方法 初筛试验 表型确证试验,培养基,CAMHB CAMHB,抗菌药物浓度 头孢泊肟,1g/mL,或 头孢他啶,0.25-128 g/mL,头孢他啶,1g/mL,或 头孢他啶,/,克拉维酸,0.25/4-128/4g,氨曲南,1g/mL,或 和,头孢噻肟,1g/mL,或 头孢噻肟,0.25-64 g/mL,头孢曲松,1g/mL,头孢噻肟,/,克拉维酸,0.25/4-64/4g,（同时用多于一种抗生素 （确证试验要求同时做上述,可提高试验灵敏度）四种纸片）,孵育条件 同标准,MIC,法 同标准,MIC,法,结果 生长,=,可疑产,ESBL,有一种抗菌素生素出现加有克拉维酸,（例：,MIC 2 g/mL,）的,MIC,没有加克拉维酸的,MIC 3,个对,倍稀释度,=,产,ESBL,质量控制 阴性对照,ATCC25922=,无生长,阳性对照,ATCC700603,阳性对照,ATCC700603,头孢泊肟抑菌圈,2 g/mL,有一种抗菌素生素出现加有克拉维,头孢他啶抑菌圈,2 g/mL,的,MIC,没有加克拉维酸的,MIC 3,个对,氨曲南抑菌圈 ,2 g/mL,倍稀释度,头孢噻肟抑菌圈,2 g/mL,头孢曲松抑菌圈,2 g/mL,二、,AmpC,-,内酰胺酶的检测,1,初筛试验,2,头孢西丁三相水解试验,3,联合用克拉维酸和氯唑西林两种抑制,平行试验,AmpC,酶的检测,1,酶的提取,冻融法 超声波破碎法,1,个菌落,1,个菌落,种入,12ml,大豆汤。,35,度震摇,4-6h,种入,40ml,大豆汤。,35,度震摇过夜,4,度,40000rpm,，离心,20min,，去上清液,4,度,4000rpm,，离心,20,分钟，去上清,沉淀物,-890,度反复冻溶,5,次 重悬在,5mlpH7.0,的,.01MPBS,中，,加入,1.5mlpH7.0,的,0.01MPBS,，超声波破碎,10,秒，间隔,15,秒重复,旋转混匀。,10,次,4,度,12,000,转,rpm,离心,20,分钟,4,度,12,000rpm,离心,20,分,取上清，,-20,度保存备用 取上清液，,-20,度保存备用,1,测定方法,0.,5,麦氏单位浓度的大肠杆菌,ATCC25922,涂在,MH,平皿上，中心贴头孢西丁纸片（,30,）,切出,3-4,个不同方向的狭缝，钩出其中的琼脂,每沟中加入待测菌的,40,的粗提物,35,度孵育过夜,观察结果,谢谢！,