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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Tanghui.pha.shzu,*,Tanghui.pha.shzu,*,Tanghui.pha.shzu,*,Tanghui.pha.shzu,*,Tanghui.pha.shzu,*,Tanghui.pha.shzu,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,高效液相色谱,High Performance Liquid Chromatography，HPLC,一、基本原理和特点：,基本原理：溶于流动相中的各组分经过固定相时，,各组分与固定相发生相互作用，由于其性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。,特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。,二、高效液相色谱仪器,1,、流程,溶剂,色谱泵,自动进样器,HPLC,色谱柱,检测器,废液,数据处理系统,2,、高效液相色谱仪组成,1,、输液系统：高压输液泵（带脱气装置）,2,、进样系统：耐高压的六通阀进样装置,3,、分离系统：色谱柱,4,、检测系统：紫外、二极管阵列、荧光、蒸发光散射等,5,、数据记录处理系统,（,l）紫外检测器,灵敏度高；,线形范围高；,对流动相的流速和温度变化不敏感；,波长可选，易于操作；,可用于梯度洗脱。,（,2,）二极管阵列检测器（,DAD）,可实施一个样品的全波长扫描,；,可同时给出紫外光谱和色谱图，便于组分定性和定量,；,可进行峰的纯度检测,；,可提供各种类型的色谱图,（,单波长色谱图、任意两个波长的吸收比色谱图、最大吸收波长色谱图以及总体吸收色谱图,）。,（,3,）示差折光率检测器,除紫外检测器之外应用最多的检测器；,可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,几乎所有物质都有各自不同的折射率，因此差示折光检测器是一种通用型检测器。灵敏度可达,10,-7,g,/,cm,3,。,主要缺点：,对温度变化敏感，灵敏度低、并且不能用于梯度淋洗。,（,4）荧光检测器,高灵敏度、高选择性；,对多环芳烃,、维生素,B,、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；,（,5）蒸发光散射检测器,由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光检测器（光电转换器）等部件构成。,色谱柱流出液导入雾化器，被载气（压缩空气或氮气）雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质无关，所以ELSD属通用型和质量型检测器。,适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。,1,、固定相：,吸附,色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。,三、,HPLC,的固定相和流动相,2,、流动相：,一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中：,对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；,对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂,；,洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（,0,）来衡量。,0,越大，表示洗脱剂的极性越强。下表列出一些常用溶剂在氧化铝吸附剂中的,0,值。在硅胶吸附剂中,0,值的顺序相同，数值可换算（,0,硅胶=077,0,氧化铝）。,3.对流动相溶剂的,要求：,（,1,）溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。,（,2）溶剂要与检测器,匹配,，,当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,（3）高纯度。由于,HPLC,灵敏度高，对流动相溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。,（4）化学稳定性好。勿选与样品发生反应或聚合的溶剂。,（5）低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力，不利于分离。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离,。,4,、实验操作：,过滤：,0.45um,或更小孔径滤膜,目的,：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。,离线脱气：超声清洗仪,目的：除去,流动相中溶解或因混合而产生的气泡,气泡,对测定的影响：,1,）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积,2,）柱中气泡使流动相绕流，峰变形,3,）检测器中的气泡产生基线波动,5,、洗脱程序：,等度洗脱,梯度洗脱,（,1,）改善分离，加快分析速度；,（,2,）改善峰形，减少拖尾；,（,3,）增加峰容量；,（,4,）强烈滞留的组分不容易残留在柱上，保持柱性能长期良好；,（,5,）下次分析时，流动相需要一段平衡时间；,（,6,）不同溶剂的,UV,吸收程度稍有差异，可能会引起基线漂移。,四、,HPLC,的色谱柱,
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