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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程的基本操作程序,原核细胞的基因结构(补充内容）,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上,游有启动子，下游有终止子,启动子,真核细胞的基因结构（补充内容）,编码区,非编码区,非编码区,与RNA聚合酶,结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,：,有调控作用,上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_的,编码区是间隔的、_的,相同点,都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。,基因操作的基本步骤,一、目的基因的获取,将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。,供体生物细胞,取出DNA,用限制酶剪去多余部分,目的基因,限制酶,一、目的基因的获取,1、目的基因主要是指_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,2、获取目的基因的常用方法,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,(1)从基因文库中获取目的基因,什么是基因文库？,什么是基因组文库？,什么是部分基因文库？,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？,目的基因的有关信息与什么相联系？,概念：,基因文库,（gene library）,基因组文库,部分基因文库,（如cDNA文库）,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library),基因组文库:,基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库.,部分基因文库:,基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.,基因组文库与部分基因文库的关系,思考：,基因文库如何构建？,如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的,多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就构成了这种生物的,cDNA文库,。这种方法称,反转录法,cDNA,文库的构建,mRNA,反转录,cDNA,(互补DNA）,DNA聚合酶,双链DNA,反转录法：,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,（3）,如何从基因文库中得到所需要的基因？,依据：目的基因的有关信息。,如：根据,基因的核苷酸序列,基因的功能基因在染色体上的位置,基因的转录产物mRNA,基因翻译产物蛋白质,等特性。,1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的,A、染色体DNA B、线粒体DNA,C、总mRNA D、tRNA,2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是,A、某生物的全套基因就是一个基因文库,B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库,C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库,D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库,A,C,（2）利用PCR技术扩增目的基因,PCR,聚合酶链式反应,是一项生物,体外复制,特定,DNA,片段的核酸合成,技术,。通过此技术，可获取大量的目的基因。,PCR技术,原理：,前提：,原料,方式,PCR扩增仪,DNA复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以_方式扩增，,即_（n为扩增循环的次数）,指数,2,n,模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子,过程,变性、退火、延伸三步曲,变性：,加热至,90,95,双链,DNA,解链成为单链,DNA,退火：,冷却至,55,60,部分引物与模板的单链,DNA,的特定互补部位相配对和结合,延伸：,加热至,70,75,以目的基因为模板，合成互补的新,DNA,链,变性,退火,延伸,1、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是,双链DNA分子为模板 ATGTG或TACAC模板链 四种脱氧核苷酸 四种核苷酸 DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶引物 温度变化 恒温,A B,C D,D,2、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是,A.540个 B.8100个 C.17280个D.7560个,B,（,3,）人工合成,根据已知的氨基酸序列合成DNA,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是,A、化学合成法 B、基因组文库法,C、cDNA文库法 D、聚合酶链反应,2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是,从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成,A B C D,A,D,3、目的基因主要是指_的结构基因。获得目的基因的常见方法有三种：（1）从基因文库中获取目的基因，根据基因的_序列，基因在_上的位置，基因的_产物mRNA，基因的_产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因，该技术是一项在_完成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的_序列，以便于合成_。（3）如果基因较小且核苷酸序列已知，可以通过_方法。,编码蛋白质,核苷酸,染色体,转录,表达,体外,核苷酸,引物,人工合成,二、基因表达载体的构建核心,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。,（2）用_切断目,的基因，使其产生_,_。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组,DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1.过程:,质粒,目的基因,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA连接酶,表达载体,同种,1.过程:,2、基因表达载体的作用,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,思考：,作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：,（1）生物之间进行基因交流，只有使用,受体生物自身基因,的启动子才能比较有利于基因的表达；,（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；,（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；,（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,3.基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是mRNA结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括,A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是,A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码,B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用,C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选,D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,3、目前转基因工程可以,A.打破地理隔离但不能突破生殖隔离,B.打破生殖隔离但不能突破地理隔离,C.完全突破地理隔离和生殖隔离,D.部分突破地理隔离和生殖隔离,C,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴,细菌或病毒侵染细胞,的途径。,三、将目的基因导入受体细胞,1、,将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,能感染,双子叶植物,和,祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒,的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒,目的基因,构建,表达载体,导入,植物细胞,插入,植物细胞染色DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,2、,将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序,:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,3、,将目的基因导入微生物细胞,常用法,：Ca,2+,处理,常用菌,：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因：,繁殖快,、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是,A结构简单、操作方便 B繁殖速度快,C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少,2、基因工程常用的受体细胞有,大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞,A B C D,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是,A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合,C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达,C,4.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是,将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养,A B C D,C,5.下列属于基因工程中导入目的基因方法的是,农杆菌转化法 基因枪法 花粉管道法 显微注射法 胚胎移植 DNA分子杂交法,A B,C D,C,(四)目的基因的检测与鉴定,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA分子杂交,表达检测,转录检测分子杂交,翻译检测,抗原抗体,杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定,抗病鉴定,活性鉴定等,个体水平的鉴定,知识延伸,DNA分子杂交技术,该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。,返 回,1、用-珠蛋白的DNA探针可以检测出的遗传病是,A镰刀状细胞贫血症 B白血病,C坏血病 D苯丙酮尿症,A,2、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是,A用于检测疾病的医疗器械,B用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子,C合成,-珠蛋白的DNA,D合成苯丙羟化酶的,DNA片段,B,思考与探究：,2
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