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Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,小时候，我们经常为魔术师的经典魔术所惊叹，他们可以把一只鸽子放入帽子里，然后变出许多鸽子。,新课导入,美国科学家,穆里斯,就变了这样一个魔术，不过他变魔术的材料不是鸽子，而是是,DNA。,他发明的,PCR技术,可以使DNA在反应30次后变为现在的,10,9,倍。,专题五 DNA和蛋白质技术,课题2 多聚酶链式反应扩增DNA技术,教学目标,知识目标,1.理解PCR原理。,2.了解PCR的应用。,3.掌握PCR的基本步骤。,能力目标,1.掌握PCR技术的基本操作。,2.体验分子生物学实验方法。,复性温度 72,讨论循环温度范围对引物-DNA双螺旋稳定性的影响及对PCR产率的影响。,学生在实验过程中巩固。,25mmol/L MgCl2溶液3L,B基因诊断的基本原理是DNA分子杂交,在DNA中加入载样缓冲液，混匀后，滴加到样品孔中,（2）至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。,(),课题2 多聚酶链式反应扩增DNA技术,向电泳槽中加入电泳缓冲溶液，移去梳子,4种脱氧核苷酸：合成子链的原料,D原核基因不能用来进行真核生物的遗传改良,取2L PCR DNA溶液，加入98L H2O，使DNA倍稀释,过程与方法,基本知识的阐述。,2.学生在实验过程中巩固。,情感态度与价值观,1.激发学生对科学的兴趣。,2.培养学生善于思考的创新精神。,教学重难点,课题重点,的原理。,的基本操作。,课题难点,PCR的原理。,内容解析,基础知识,DNA复制的条件,解旋酶：打开DNA双链,DNA母链：提供DNA复制模板,4种脱氧核苷酸：合成子链的原料,DNA聚合酶：催化合成DNA子链,引物：使DNA连接脱氧核苷酸,思考：,能否在体外模拟体内DNA复制条件，进行DNA扩增？,PCR技术,PCR技术的原理,打开DNA双链,在80-100温度范围内，DNA变性，双螺旋结构解体，双链打开,DNA母链,解体后的双链为两条母链,合成子链原料,四种脱氧核苷酸,引物,与两条模板链结合的两种引物,DNA聚合酶,耐高温的TaqDNA聚合酶,温度,变性温度 94,复性温度 72,延伸温度 55,温度90，双链解旋为两条单链,PCR过程,变性,90,温度50摄氏度，两种引物分别与两条单链DNA结合,复性,50,温度70，在DNA聚合酶的作用下，根据碱剂互补配对原则合成新的DNA链,延伸,70,延伸,第二轮,变性,1,2,A链PCR,复性,1,2,延伸,1,2,PCR终产物,B链PCR,变性,B,B1,B2,复性,B1,B2,PCR终产物,延伸,B1,B2,第三轮,A1,B2,同A链第二轮PCR反应,同B链第二轮PCR反应,试验设计,利用PCR技术扩增双歧杆菌的DNA的片段,实验器材,双歧杆菌,培养基,离心机,微量移液器,化学试剂,PCR仪,1.双歧杆菌的培养,培养24h,培养基配方：,大豆蛋白胨 5g 酵母提取物 10g,微量盐溶液 40ml 葡萄糖 10g,半膀氨酸盐酸盐 0.5g 0.1%胰胨 5g,刃天青 1ml PH=7,实验过程,操作,菌液离心，保留底部双歧杆菌沉淀,在双歧杆菌沉淀中加入裂解液，使细胞裂解，释放DNA,处理,2.提取DNA,55加热孵育3h 90加热10min 冷冰中冷却 离心,1.菌体处理,4.其它组分添加,DNA上清液10L,10倍扩增缓冲液 5L,25mmol/L MgCl2溶液3L,20mmol/L4种脱氧核苷酸的均匀混合液1L,Taq聚合酶1L,两种引物各,蒸馏水29L,预变性,94，5min,30次重复反应,94，30s,55，30s,最后一次,94，1min,55，30s,72，1min,72，1min,反应,变性,复性,延伸,产物检验,分光光度计法,取2L PCR DNA溶液，加入98L H,2,O，使DNA倍稀释,以蒸馏水为对照，在260nm处测样品DNA的光吸收值,根据公式计算DNA含量,DNA含量（g/mL）=,50（260nm度数）稀释倍数,结果分析与评价,根据公式计算DNA片段的含量比扩增前增加了了多少倍。,相关链接,琼脂糖凝胶电泳法检测DNA含量,1.配制浓度为的琼脂糖凝胶，倒入电泳槽中，插好梳子,反应产物的特异性取决于(),50（260nm度数）稀释倍数,与两条模板链结合的两种引物,如果要使用PCR扩一段已知的DNA序列，你打算如何设计引物？,PCR实验的特异性主要取决于（）,接通电源，电泳20-40min,5-CGAAGGTGTCCAG 5-GTTAGGGCATAC,引物：使DNA连接脱氧核苷酸,原核基因可以用来进行真核生物的遗传改良，例如用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因改良棉花。,学生在实验过程中巩固。,D原核基因不能用来进行真核生物的遗传改良,讨论循环温度范围对引物-DNA双螺旋稳定性的影响及对PCR产率的影响。,GC对普遍比AT对更倾向于非特异性的复性，所以GC含量高的引物比AT含量高的引物更适合于PCR反应。,25mmol/L MgCl2溶液3L,引物序列的结构和长度,2.向电泳槽中加入电泳缓冲溶液，移去梳子,3.在DNA中加入载样缓冲液，混匀后，滴加到样品孔中,4.接通电源，电泳20-40min,+,-,5.EB 溶液染色，在紫外仪上观察电泳带及其位置，判断扩增情况,观察电泳带的粗细以及分布评价扩增的效果。,课堂小结,在体外制造与体内相同的环境，进行DNA复制反应,缓冲溶液,DNA模板,与两条模板链结合的两种引物,PCR原理,PCR反应条件,四种脱氧核苷酸,耐热的DNA聚合酶,合适的温度,变性,复性,延伸,PCR反应过程,DNA含量检测,紫外分光光度计法,凝胶电泳法,高考链接,1.,2006.广东,下列关于基因工程应用的叙述，正确的是（）,A基因治疗就是把缺陷基因诱变成正常基因,B基因诊断的基本原理是DNA分子杂交,C一种基因探针能检测水体中的各种病毒,D原核基因不能用来进行真核生物的遗传改良,B,解析：,基因治疗是把健康的外源基因导入到有缺陷基因的细胞中；一种基因探针能检测相应的某一种特定的病毒；原核基因可以用来进行真核生物的遗传改良，例如用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因改良棉花。,2.,2005.全国卷,检测基因序列所必须的酶是（）A.解旋酶连接酶C.限制性内切酶聚合酶,C,解析：,A.解旋可以用加热法。,B.DNA连接酶是在取得目的基因、并打开运载体后把它们组合起来时使用的。,D.RNA聚合酶是在转录或者RNA自我复制时使用,3.,2002.广东,判断：DNA复制中单个脱氧核苷酸在DNA酶的作用下连接合成新的子链,(),解析,DNA酶包括DNA聚合酶、DNA解旋酶、DNA内切酶等，此处应当指DNA聚合酶。,选择题,反应产物的特异性取决于(),A退火温度 B引物碱基组成和长度,C循环次数 D.A+B+C,D,2.PCR实验的特异性主要取决于（）,聚合酶的种类,B.反应体系中模板DNA的量,C.引物序列的结构和长度,D.四种dNTP的浓度,C,简答题,1.PCR反应包括引物与DNA模板链间的解链与复性。讨论循环温度范围对引物-DNA双螺旋稳定性的影响及对PCR产率的影响。,答：由于GC对间是三个氢键的作用力，比两个氢键作用力的AT对要稳定，因此DNA的解链与退火都是依赖于G+C的含量与A+T的含量的比例。GC对普遍比AT对更倾向于非特异性的复性，所以GC含量高的引物比AT含量高的引物更适合于PCR反应。,2.你打算扩增下图所示的两段序列之间的DNA，请从所列出引物中选出合适的一对，,5-GACCTGTGGAAGC CATACGGGATTG-3,3-CTGGACACCTTCG GTATGCCCTAAC-5,引物1,引物2,5-GACCTGTGGAAGC 5-CATACGGGATTG,5-CTGGACACCTTCG 5-GTATGCCCTAAC,5-CGAAGGTGTCCAG 5-GTTAGGGCATAC,5-GCTTCCACAGGTC 5-CAATCCCGTATG,答：引物1：5-GACCTGTGGAAGC,引物2：5-CAATCCCGTATG,的基本原理是什么？用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息？,答：,（1）利用DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。,（2）至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列,。,教学习题答案,1.请绘图表示PCR反应的前三个循环步骤。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为膜拜，请计算在30次循环反应后，反应物中大约有多少个这样的DNA片段。,答：,（1）前三个循环步骤详见课件“基础知识”部分。,（2）PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为循环次数。则DNA在30次循环后应该约有10亿个这样的片段（2n1073741824）,2.如果要使用PCR扩一段已知的DNA序列，你打算如何设计引物？,答：PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验，感兴趣的学生可以参考分子克隆实验指南（见本专题参考书目），书中有详尽的论述。,再见,
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