发酵工程（全套课件451P）

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,发酵工程,Fermentation Engineering,考 核 方 式,闭卷考试占,70,高水平科技文献阅读翻译占,15,平时课堂提问、作业与考勤占,15,第一章 绪 论,本章内容,一、发酵工程定义及在生物技术中的地位,二、发酵工程开展简史,三、发酵工业的特点及其应用范围,四、工业发酵的类型与典型过程,五、发酵工程前沿及应用前景,何谓发酵,？,ferver,：,发泡、沸腾,fermentation,微生物的,发酵现象,请看下面现象,对发酵现象的不同理解 两种角度能量、产物,生,物,化,学,家,侧重能量代谢：,1、能够在氧分子参与下进行有氧呼吸产生能量的生物可以进行：,有氧呼吸、糖酵解、厌氧呼吸兼性微生物,1有氧呼吸氧供给充分、有机物氧化彻底、产生大量能量,2糖酵解暂时缺氧、有机物氧化不彻底、产生少量能量,2、无氧呼吸：特指那些不需要氧的微生物所进行的能量代谢。,指有机物经彻底或不彻底氧化，所脱下来的电子最后传给外源的无机氧化物(个别是有机氧化物)并释放较少能量。 根据最终电子受体不同，无氧呼吸分为：硝酸盐呼吸、硫酸盐呼吸、硫呼吸、碳酸盐呼吸及延胡索酸呼吸等。,对发酵现象的不同理解 两种角度能量、产物,发酵是指有机化合物进行无氧代谢,释放能量,的过程,厌氧发酵是厌氧菌借助氧化-复原反响释放能量的过程,发酵是酵母无氧呼吸,产生能量,的过程,需氧发酵是好氧生物在受到分子态氧短缺限制时的不,完全氧化,释放能量,的过程,生,物,化,学,家,生物化学家看待微生物发酵过程：,工业,微生,物学,家,利用生物细胞包括动、植物细胞,培养来生产产物的所有过程？需氧过程、细胞工程,发酵是利用微生物培养来,生产产物,的无氧或需氧的任何过程,侧重产品的生产：,发酵现象的本质,显微镜观察：微生物,著名的巴斯德实验：微生物作用,著名的毕希纳实验：酵素酶的作用,2.,发酵工程概念？,微生物细胞加工技术过程优化与放大,传统发酵工程：利用微生物的生长和代谢活动来大量生产人们所需产品的过程理论与工程技术体系。该技术体系主要包括菌种选育与保藏、菌种扩大生产、代谢产物的生物合成与别离纯化制备等技术集成。,现代发酵工程：是将DNA重组及细胞融合技术、酶工程技术、组学及代谢网络调控技术、过程工程优化与放大技术等新技术与传统发酵工程融合，大大提高传统发酵技术水平，拓展传统发酵应用领域和产品范围的一种现代工业生物技术体系新一代工业生物技术。,强调现代生物技术、控制技术和装备技术在传统与现代发酵工业领域的集成应用。,传统发酵工业：,酿造及食品,业、抗生素、氨基酸、核苷,酸、有机酸、饲料添加剂、,微生态制剂、生物农药、生,物肥料等,现代发酵工业：,基因工,程药物、细胞工程药物、,疫苗；替代石油工业的,大宗量的生物基化学品等，,以及传统发酵工业升级。,传统大型发酵工,业的中央控制,现代发酵工业,的中央控制,3.,发酵工程在生物技术中的地位,生物技术：应用自然科学和工程学的原理，依靠生物及其细胞的催化作用，将物料进行加工以提供产品或为社会效劳的技术。,发酵工程是生物技术的应用基,础，是生物技术产业的核心。,分离和纯化产品。,包括固液分离技术、细,胞破壁技术、产物纯化,技术，以及产品检验和,包装技术等,下游,技术,发酵过程控制，主要包,括发酵条件的调控，无,菌环境的控制，过程分,析和控制等,中游技术,广义发酵工程对生物学和工程学的要求,优良种株的选育和保,藏（包括菌种筛选、改造，,菌种代谢路径改造等），,上游,技术,上中下游相互关联！,生物技术体系,生化工程,酶工程,细胞工程,发酵工程,产物,产品,产品,基因工程,产品,强调过程优化与控制,一发酵工程开展简史,1900以前 自然发酵阶段,19001940 纯培养技术的建立,19401950 通气搅拌纯培养发酵技术的建立,19501960 诱变技术与代谢控制发酵技术的建立,19601970 开拓发酵原料时期石油发酵时期,1970年以后 进入基因工程菌发酵时期，以及细胞,大规模培养技术的全面开展。,近年来，以现代生物技术和过程工程技术为根底的,现代发酵工业突飞猛进。,自然发酵阶段,主要是酿造工业,主要产品：酒、酒精、醋、,啤酒、干酪、酸乳等,17世纪，能在容量为1500桶一桶约136升的,木质大桶中进行第一次真正的大规模酿造,1757年应用温度计；1801 使用原始热交换器,主要特点：嫌气发酵，非纯种培养 ，产品质,量不稳定,纯培养技术的建立,Koch首先创造固体培养基，建立细菌,的纯粹培养,Petri创造一种培养皿(petri dish)用于,微生物平板别离,Winograsky和 Beijerink创造富集培,养法，别离特定的微生物,主要产品：酵母、甘油、乳酸、丙酮丁醇等,第一次世界大战， Weizmann 创造了丙酮丁醇发酵，建立了真正的无杂菌发酵。,在面包酵母的生产中首先采用了分批补料培养技术,主要特点：纯培养为主、嫌氧发酵，产品产量,质量控制水平大大提高,纯培养技术的建立,通气搅拌发酵技术的建立,标志：,纯种培养深层发酵生产青霉素,主要技术进展：,通气搅拌解决了液体深层培养的供氧问题。,无菌空气、培养基灭菌、无污染接种、大,型发酵罐的密封与抗污染设计解决了耗氧,发酵中的杂菌污染问题。,主要特点：耗氧发酵实现规模化纯培养发,酵，一系列过程工程技术创新,意义：,推动抗生素工业乃至整个发酵工业快速开展,建立了完整的好氧发酵放大技术及装备,奠定了现代发酵工业的理论和实践根底,通气搅拌发酵技术的建立,代谢控制发酵技术的建立,基于代谢途径及其调控实现微生物菌种选育和控制发酵。,代谢控制发酵技术：应用生物化学的代谢知识和遗传学理论，选育微生物突变株，从而调控微生物代谢，大量积累目标发酵产物。,主要应用：,氨基酸,及核苷酸等基于初生代谢产物,的发酵生产，以及有机酸,、,抗生素等,开拓新的发酵原料时期,目的：以烃类为碳源生产微生物细胞作为饲,料蛋白质的来源,技术进步：,开展了高压喷射式、强制循环式等多种发,酵罐及其发酵技术,计算机和自动控制技术的运用：灭菌和发,酵过程自动控制，促进发酵工业朝连续化、,自动化方向开展,特点,：,解决发酵原料及人畜争粮问题；,规模和自动化程度显著提高，能耗过大。,开拓新的发酵原料时期,基因工程阶段现代发酵工业新阶段,主要标志,基因工程产品生产以及基因工程技术应用,世界上已批准上市的基因工程药物有几十种，如：胰岛素、人生长激素等。,主要特点,基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术以及发酵过程优化及放大技术的全面进步,高产微生物代谢产物及非微生物代谢产物的基因工程菌构建及产品的发酵生产,主导碳氧经济开展，碳氢经济的替代及生物炼制技术的兴起,基因工程阶段现代发酵工业新阶段,人胰岛素人生长激素,(,GH,),表皮生长因子,(,EGF,),肿瘤坏死因子白细胞介素,-2(,IL-2,),尿激酶原猪生长激素,(,PGH,),牛生长激素,(,BGH,),纤维素酶,-,干扰素乙型肝炎疫苗集落刺激因子,(,CSF,),促红细胞生成素,(,EPO,),抗血友病因子组织溶纤原激活剂,(,t-PA,),局部利用基因工程技术研制的产品,发酵工程的主要前沿进展,原料拓展：,可再生资源的加工和综合利用如纤维素原料,过程优化技术,多尺度生物反响器优化控制技术,生物炼制,高产量,：,微生物生理、遗传、营养及环境因素,高转化率,：,微生物代谢途径和过程条件,高效率：微生物反响动力学和系统优化,以高产量、高转化率和高效率及低本钱为目标的发酵过程优化技术,低本钱：技术综合及产业化技术集成,环境友好,：,开发清洁生产技术,发酵过程优化技术,条件确定,过程优化,初始条件,过程分析,过程强化,1,基于组学技术的高通量菌种改造和筛选,2,基于组学和生物信息学代谢途径分析优化,菌种改造,3,基于实时代谢流分析、代谢途径模型,与自动控制技术的发酵过程优化控制,发酵工艺优化,4,基于发酵液及产品特性的高收率、低,成本、高质量和环境友好的提取精制,技术集成,发酵产物分离纯化,5,基于源头防治与过程监控的资源节约,与废物资源化清洁生产技术集成,综合治理技术优化,一发酵工业的特点,发酵过程一般是在常温常压下进行的生化反响，,反响平安，要求条件较简单。,可用较廉价原料生产较高价值产品。,反响专一性强。,能够专一性地和高度选择性地对某些较为复杂的,化合物进行特定部位的生物转化修饰。,发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。,菌种是关键。,发酵生产不受地理、气候、季节等自然条件限制。,一发酵工业的特点,二发酵工业的范围,微生物菌体,酶制剂,代谢产物,生物转化,微生物特殊机能的利用,利用微生物消除环境污染,利用微生物发酵保持生态平衡,微生物湿法冶金,利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域,微生物菌体,传统菌体发酵,工业,现代菌体发酵工业,酵母发酵,菌体蛋白单细胞蛋白发酵,杀虫剂,：苏云金杆菌，蜡样芽孢杆菌，侧孢芽孢杆菌；白僵菌、绿僵菌,疫苗,新的菌体发酵产品,:,药用功能菌体,茯苓菌,茯苓,担子真菌,灵芝、香菇类,虫草头孢菌,密环菌,微生物菌体,面包酵母,藻类,芽孢杆菌和伴孢晶体,虫草头孢菌发酵生产虫草,酶制剂,广泛用于医药工业、食品和轻工业、石油化工,酶试剂盒：医用诊断试剂盒、工业分析试剂盒等,药用酶制剂：胆固醇氧化酶，葡萄糖氧化酶等,食品工业用酶制剂：果胶酶，淀粉酶等,基因重组技术用酶制剂：核酸酶nuclease，包括DNA、RNA的内切酶、外切酶，DNA限制性内切酶、DNA连接酶等。,饲料酶制剂：木聚糖酶、-葡聚糖酶、纤维素酶等,微生物转化,在用维生素,C,一步和二步发酵法生产中,起主要氧化作用的葡糖酸杆菌对作用底物,(D-,山梨醇或,L-,山梨糖,),的分子结构进行特异性改变。,一工业发酵的类型,固体发酵,厌氧发酵,需氧发酵,兼性厌氧发酵,液体发酵包括液体深层发酵,按培养基的物理性状 浅盘固体发酵,深层固体发酵机械通风制曲,按微生物对氧的不同需求,按发酵工艺流程,分批发酵,补料分批发酵,连续发酵,单级恒化器连续发酵,多级恒化器连续发酵,带有细胞再循环的单级恒化器连续发酵,一工业发酵的类型,按菌的种类,单菌种发酵,多菌种混合发酵混合菌发酵,新开展的微生物培养方法,载体培养,微载体以细小的颗粒作为细胞载体，通过搅拌悬浮在培养液内，使细胞在载体外表繁殖成单层的一种细胞培养技术。,两步法液体深层培养,菌体生长和产酶条件不同，先提供适宜的生长条件，收集到大量菌体，再移入发酵 培养基中进行产物发酵。,二发酵工业的根本生产过程,1.,用作种子扩大培养及发酵生产的各种培,养基的配制；,2.,培养基、发酵罐及其附属设备的消毒灭菌；,3.,扩大培养出有活性的适量纯种，以一定比,例接种入发酵罐中；,4.,控制最适发酵条件使微生物生长并形成大量的代谢产物；,5.,将产物提取并精制，以得到合格的产品；,6.,回收或处理发酵过程中所产生的三废物质。,二发酵工业的根本生产过程,二发酵工业的典型过程深层发酵过程,发酵工业开展趋向及应用前景,基因工程的开展为发酵工程带来新的活力。,采用发酵技术进行高等动植物细胞培养，具有诱人前景。,不断开发和采用大型节能高效的发酵装置，,计算机自动控制将成为发酵生产控制的主要手段。,强调代谢机理与调控研究，使微生物的机能得到进一步开发。,生态,型发酵工业的兴起：,清洁生产,。,再生资源的利用。,混合菌发酵,强调微生物群落与功能研究，提高发酵效率。,发酵工业开展趋向及应用前景,清洁生产,按照联合国环境规划署UNEP的定义：“清洁生产是一种新的创造性的思想，该思想将整体预防的环境战略持续应用于生产过程、产品和效劳中，以增加生态效益和减少人类及环境的风险。对生产过程，要求节约原材料和能源，淘汰有毒原材料，减降所有废弃物的数量和毒性；对产品，要求减少从原材料提炼到产品最终处置的全生命周期的不利影响；对效劳，要求将环境因素纳入设计和所提供的效劳中。,混合菌发酵的应用,传统酿造和食品发酵工业：白酒，酱油、醋、豆豉,有机废弃物工业、城市和农业的发酵处理与转化：,生物能源：生物制氢、生物制沼气,生物饲料,生物肥料,课 程 内 容,第一章 绪论,第二章 发酵工业菌种,第三章 发酵工业培养基设计讨论课,第四章 发酵工业的无菌技术,第五章 发酵工业的种子制备讨论课,第六章 发酵动力学,第七章 发酵工业中氧的供需,第八章 发酵罐放大与设计,第九章 发酵过程优化与控制,第十章 发酵经济学讨论课,结合实践自学：发酵产物别离纯化以及产品制备,发酵工业的洁净生产技术,学习重点,根本过程,过程优化,过程控制,过程放大,一条主线、两个重点、三个层次、四个目标,发酵工,艺过程,过程优,化放大,反响器,细胞、分子,高转化率,高产量,高效率,低本钱,发酵工程是连接生物科学、生物技术和,生物工程的桥梁，生物科学与技术,成果的推广应用离不开发酵工程！,Thank you for your attention !,过量,运动后肌肉会有酸痛感，就是因为肌体在缺氧状态下进行糖酵解产生了乳酸等,高等生物动物、植物和好气性微生物长期进行糖酵解发酵危害很大：,由于能量缺乏加速了底物的利用导致能量物质枯竭,产生大量有毒的底物不完全氧化的中间体：酒精、乳酸等,甚至导致局部细胞坏死或整体死亡,人类脑缺氧非常危险、长期剧烈运动有损健康、提倡有氧运动,本章内容,一、常用的工业微生物,二、发酵工业菌种筛选,三、发酵工业菌种改进,发酵工业菌种,第二章,一、常用的工业微生物,p13,1,、细菌,醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌,乳酸杆菌,枯草杆菌,丙酮丁醇梭菌,大肠杆菌,谷氨酸棒状杆菌,2,、酵母菌,酿酒酵母,假丝酵母属,产朊假丝酵母,解脂假丝酵母,热带假丝酵母,毕赤酵母属、汉逊酵母属,一、常用的工业微生物,3,、霉菌,曲霉属,米曲霉,黑曲霉,青霉属,青霉菌：点青霉、产黄青霉,桔青霉,根霉属,德氏根霉,米根霉、小麦曲根霉,红曲霉属,紫红曲霉,一、常用的工业微生物,4,、放线菌,链霉菌属,小单孢菌属,地中海诺卡氏菌,一、常用的工业微生物,5,、未培养微生物,p14,定义：指迄今所采用的微生物纯培养别离及培养方法还未获得纯培养的微生物。,其在自然环境微生物群落中占有非常高的比例，约为99。,一、常用的工业微生物,二、发酵工业菌种别离筛选,菌株别离：将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行别离、筛选，进而得到所需微生物的过程。,1.,菌种选择的总趋势,野生菌变异菌,自然选育代谢控制育种,诱发基因突变基因重组的定向育种,一发酵工业菌种筛选的总趋势与要求,2.,菌种选择的要求,p15,能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的产物产量高、易于回收；,生长速度和反响速度较快，发酵周期较短；,培养条件易于控制；,抗噬菌体及杂菌污染的能力强；,2. 菌种选择的要求续p15,菌种不易变异退化；,对放大设备的适应性强；,菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。,二别离筛选原理与技术,1. 筛选的指导思想,2. 别离筛选工作在实际中应用的几个方面,3. 新种别离筛选原理与技术,1,、 筛选的两种指导思想,先别离纯化，再结合工艺要求进行筛选。,别离纯化同时富于筛选条件，一步得出所需菌株。,结果有两种可能：,获得适于工业发酵菌株,只获得选育所需的出发菌株,2、 别离筛选工作在实际中应用的几个方面,从被污染的生产及科研用菌中别离目的菌；,生产中长期使用的菌种的定期别离筛选 ；,从各种育种方法处理的微生物材料中别离筛选适于工业目的的优良菌株 ；,从保藏机构获取菌种,从菌种和大自然中别离新菌株,寻找新的发酵产品的产生菌；,寻找老产品的新的优良菌株。,3、新种别离与筛选的步骤 p15,调查研究包括资料查阅,试验方案设计,含微生物样品的采集 如何使样品中含所需微,生物的可能性大？,样品预处理 如何在后续的操作中使这种可,能性实现,菌种别离,根据目的菌株及其产物特点分,选择性别离方法 随机别离方法,(定向筛选选择压力) (用筛选方案- 检测系统进行间接别离,富集液体培养 固体培养基条件培养,(初筛),菌种纯化,复筛,菌种纯化,初步工艺条件摸索 再复筛 生产性能测试,较优菌株,1-3,株,保藏及进一步做生产试验 某些必要试验和,或作为育种的出发菌株 毒性试验等,(1),、含微生物样品的采集,p16,1、采样时应注意的问题:,土壤微生物的分布,土壤的有机质含量和通风情况,土壤植被情况,采样季节,土壤的酸碱度,2、对于别离筛选新菌种，还存在另两个选择标准：,土壤来源广泛,在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中寻找新菌种,2、样品的预处理 p16,目的：提高别离效率,方法：,物理方法：热处理；膜过滤法；离心法,化学方法：化学成分增加特定微生物的数量,诱饵法：富集目的菌,3、别离方法的选择,根据目的菌有无选择性特征来选择别离方法,菌种的营养特征独特,生长特征独特,无选择性特征 根据产物的特征进行,随机别离,选择性别离,A、选择性别离原理和技术,1,、生长条件的选择与控制原理,控制营养成分,控制培养基酸碱度,添加抑制剂,控制培养温度,控制通气条件,2、选择性别离技术,富集液体培养技术,固体培养技术,施加选择压力，进行定向筛选,A、选择性别离原理和技术,、富集液体培养,p17,增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术,技术特点：,给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件,培养方式,分批培养方式：以最大比生长速率 max筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题,连续培养方式：以比生长速率 筛选,A,B,S,0,基质浓度对A、B两种菌的比生长速率的影响,当SS0时，富集什么菌株？,连续培养方式：以比生长速率 筛选,连续富集培养技术别离菌株的优点,别离的菌株特别适合连续发酵生产过程,有利于别离具有某种工业生产特性的菌株,可以筛选出能共生的稳定混合培养物,、,固体培养技术,常用于别离某些酶产生菌,选择压力：在选择培养基中参加所需酶的基质,如：淀粉酶的别离,B、随机别离原理与技术,从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机别离的菌落中筛选出所需的目的菌。,技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法确实定。,随机别离技术举例,抗生素产生菌的筛选,生长因子产生菌的筛选,抗生素产生菌的筛选,筛选模型：试验菌,筛选方法：,铺菌法,复印平板法,液体培养筛选,抗药性筛选,筛选模型：氨苄青霉素和-内酰胺酶产生菌克雷白氏菌协同,I II,无试样时不含棒酸时，I对II菌作用不大,有试样时含棒酸时，I对II菌恢复药效，棒酸抑制水解酶活性,固体培养筛选,试验菌 代表微生物类型,金黄色葡萄球菌,209p,革兰氏阳性球菌,枯草杆菌,6633,革兰氏阳性杆菌,大肠杆菌 革兰氏阴性肠道细菌,耻垢分枝杆菌,607,结核杆菌,白色念珠菌 酵母状真菌,青霉菌,丝状真菌,生长因子产生菌的筛选,筛选模型：营养缺陷型试验菌,筛选方法：利用被别离的微生物产物能否促进营养缺陷型试验菌生长,氨基酸产生菌的筛选,样品,预处理,初筛除真菌,在别离平板上生长获得多个单菌落,复印平板copy 法,平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 对应到copy前相应,u.v线杀死长好的菌落 位置，找到目的菌落,再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂,培养后,产氨基酸菌落周围有生长圈,目的菌落进行液体培养，,对产物进行定量测定,筛选产物含量高的菌株,4、几种典型微生物的别离筛选方法举例,细菌,放线菌,真菌,细菌别离：以乳酸菌为例,取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中,加麦芽汁至瓶口处，封塞，25培养24-48h,培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌,用选择性培养基分批富集培养2-3代,稀释别离法别离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基,根据透明圈挑选菌落,性能测定镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定,Rf值定性,有机酸呈黄斑点,乳酸生成量测定滴定法,放线菌的别离：以产链霉素菌种的别离为例从退化菌种中筛选,取工业发酵液含孢子样品1环,放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀,采用稀释法制平板，获取单菌落,斜面保藏 高产菌恢复,根据高产菌的特点，选择目的菌落,放大培养，发酵液性能测试,筛选模型：形态依据,真菌的别离筛选：以啤酒酵母的别离为例,取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7,稀释别离法,取0.1ml 参加固体培养基铺平皿2,在麦芽汁固体培养基上，25培养48-72h,形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用,纯化，采用平板别离法进一步纯化，至少反复三次,生成子囊孢子速度测定 发酵力测定,性能测定 热死温度测定,凝集力测定,双乙酰含量测定,菌种选育改进的具体目标p23,提高目标产物的产量,提高目标产物的纯度，减少副产物,改进菌种性状，改善发酵过程,改变生物合成途径，以获得高产的新产品,三、发酵工业菌种改进,发酵工业菌种改进方法p25,常规育种,(,诱变育种,),细胞工程育种,基于代谢调节的育种技术,基因工程育种,蛋白质工程育种,代谢工程育种,出发菌株的选择,工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株parent strain。,一般有三种：,菌悬液的制备,诱变,变异菌株的别离和筛选,一、诱变选育的程序,前培养,从自然界别离得到的野生型菌株；,通过生产选育，即由自发突变经筛选获得的高产菌株；,已经诱变过的菌株。,二、诱变育种方案设计,1,、出发菌株的选择,纯种,：,排除异核体或异质体的影响。,有利于合成发酵产物,：不仅选产量高的，还要考虑其他因素，如产孢子早而多，色素多或少，生长速度快等。,对诱变剂敏感且变异幅度广：,可以提高变异频率，而且高产突变株的出现率也大。,2,、诱变剂的种类和选择,物理诱变剂,化学诱变剂,各种射线，如紫外线焦耳、X射线库仑/千克、射线、射线、射线和超声波等,甲基磺酸乙酯EMS、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。,一般正突变较多出现在偏低剂量中，而负突变那么较多出现于偏高剂量中。,对于经过屡次诱变而提高了产量的菌株，在较高剂量负突变率更高。,目前处理剂量采用的死亡率为7080。,各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间,诱变剂,诱变剂的剂量,处理时间,缓冲剂,中止反应方法,亚硝酸（,HNO,2,）,0.01,0.1mol/L,5,10min,pH,值,4.5,，,1mol/L,醋酸缓冲液,pH8.6,，,0.07,磷酸二氢钠,硫酸二乙酯（,DES,）,0.5,1,10,30min,，,孢子,18,24h,pH,值,7.0,，,0.1mol/L,磷酸缓冲液,硫代硫酸钠或大量稀释,甲基磺酸乙酯（,EMS,）,0.05,0.5mol/L,10,60min,，,孢子,3,6h,pH,值,7.0,，,0.1mol/L,磷酸缓冲液,硫代硫酸钠或大量稀释,亚硝基胍（,NTG,）,0.1,1.0 mol/mL,，,孢子,3mg/mL,15,60min,，,90,120min,pH,值,7.0,，,0.1mol/L,磷酸缓冲液或,Tris,缓冲液,大量稀释,亚硝基甲基胍（,NMU,）,0.1,1.0 mol/mL,15,90min,pH,值,6.0,7.0,，,0.1mol/L,磷酸缓冲剂或,Tris,缓冲液,大量稀释,氮芥,0.1,1.0 mol/mL,5,10min,NaHCO,3,甘氨酸或大量稀释,乙烯亚胺,1:1000,1:10000,30,60min,硫代硫酸钠或大量稀释,羟胺（,NH,2,OH,HCl,）,0.1,0.5,数小时或生长过程中诱变,大量稀释,氯化锂（,LiCl,）,0.3,0.5,加入培养基中，在生长过程中诱变,大量稀释,秋水仙碱（,C,22,H,25,NO,6,）,0.01,0.2,加入培养基中，在生长过程中诱变,大量稀释,3,、突变的诱发,A,、诱变剂接触,DNA,分子,B,、,DNA,损伤的修复,C,、从突变到突变型,光复活作用,切补修复,重组修复,SOS,修复系统,DNA,多聚酶的校正作用,表型延迟：诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，故某一突变还是无法反映在当代的表型上，只有当经过DNA的复制和细胞分裂后，这一变异才会在表型上表达出来，于是出现了不纯菌落。,菌种改进-诱变育种,上节知识回忆,出发菌株的选择,菌悬液的制备,诱变,变异菌株的别离和筛选,前培养,4,、筛选,A,、 制定筛选方案,方案设计的中心内容是确定诱变筛选流程。,B,、营养缺陷型的筛选方法,一般经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等。,淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差异杀菌法和饥饿法等。,营养缺陷型菌株的检出方法有：,逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。,与筛选营养缺陷型突变株有关的三类培养基,根本培养基MM-：但凡能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。,完全培养基CM+：满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。,补充培养基SM：在MM中有针对性地参加一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。补充培养基的符号可根据参加的是A或B等代谢物，而分别用A或B等来表示。,1,、抗生素法,:,(1),青霉素法,:,主要适用于细菌。,淘汰野生型菌株,含青霉素的根本培养基,极少的野生型生长，大部淘汰,浓缩缺陷型,(2),制霉菌素法,:,适于真菌。,淘汰野生型菌株,含制霉菌素的根本培养基,极少的的野生型，大部淘汰,浓缩缺陷型,2,、菌丝过滤法,:,适用于丝状生长的真菌或放线菌。,野生型菌丝,根本培养基,擦镜纸等过滤,浓缩的缺陷型,夹层培养法,检出营养缺陷型菌株,无菌根本培养基,无菌根本培养基,含诱变菌根本培养基,完全培养基,培养后，标记出现的菌落,第二次培养后的小菌落多为缺陷型,限量补充培养法,限量根本培养基,野生型,缺陷型,逐个检出法,根本培养基,完全培养基,营养缺陷型,(三诱变育种应考虑的因素P25,1、选择适宜的出发菌株,适宜的出发菌株就是通过育种能有效地提高目标产物产量的菌株。,出发菌株最好已具备一些有利的性状，如生长速度快、营养要求低和产孢子早而多的菌株。,2,、复合诱变剂的使用,复合处理可以将两种或多种诱变剂分先后或同时使用，也可用同一诱变剂重复使用。,诱变剂复合处理的效果往往好于单独处理。,3,、诱变剂剂量的选择,仅仅采用诱变剂的理化指标控制诱变剂的用量常会造成偏差，不利于重复操作。,不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同,就一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但到达一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。,4,、变异菌株的筛选,一般要经过初筛和复筛两个阶段。,如,:,青霉素产生菌高产突变菌种的筛选,初筛：诱变后稀释涂布平板培养挑单个菌落到斜面培养将斜面上的菌落逐个接种到摇瓶振荡培养测抗生素效价 超过对照效价10%以上的菌种，进行复筛。,复筛：过程与初筛根本相同，不同的是一般将斜面上的单个菌落接种到三个摇瓶中，得出平均效价。复筛可进行13次。,由此筛选出的高产稳定菌种还要经过小型甚至中型试验，才能用到发酵生产中。,1,、工业上对菌种选择有何要求？,2,、诱变育种应注意哪些问题？,作业,1,、单位培养基能产生最大量的目的产物,2,、能使目的产物的合成速率最大,3,、副产物合成的量最少,4,、质量稳定、价格低廉、易于长期获得,5,、尽量不影响后处理,发酵工业培养基的要求,P41,第三章 发酵工业培养基设计,本章内容,1,培养基的类型及功能,2,培养基的设计及优化,发酵培养基的成分及来源,培养基的类型和用途,1,培养基的类型及功能,一,、培养基的类型和用途,根据来源分：,根据主要成分或使用目的分：,根据用途分：,天然培养基,合成培养基,半合成培养基,基础培养基,加富培养基,鉴别培养基,选择培养基,孢子培养基,供制备孢子用；,种子培养基,满足菌种生长；,发酵培养基,满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累,营养不能太丰富，尤其是有机氮源；,无机盐浓度要适量，否那么会影响孢子量和孢子颜色；,注意pH和湿度,营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素含量也要高一些,除含有菌体生长所必须的营养物外，还要有产物所需的特定元素、前体物质和促进剂等,生理代谢,菌种筛选,种子培养,发酵培养,谷氨酸发酵种子培养基和发酵培养基配方,培养基成分,种子培养基,发酵培养基,淀粉水解糖,(%),2.5,12.5,玉米浆,(%,2.5-3.5,0.5-0.8,K,2,HPO,4,(%),0.15,0.15,MgSO,4,(%),0.04,0.06,尿素,0.4,3,Fe,2+,Mn,2+,各,2ppm,各,2ppm,不同的发酵产物，不同的菌种所选择的发酵培养基是不同的。,白酒 (chinese spirit)发酵：固体发酵培养基；,果酒(fruit spirit)发酵：果汁,；,啤酒(beer) 发酵：麦芽汁液体培养基；,酒精(alcohol)发酵：淀粉糖化醪 ；,氨基酸(amino acid)发酵：水解糖液加其他营养成分；,柠檬酸(citric acid)发酵：淀粉液化醪 ；,乳酸(lactic acid)发酵：淀粉糖化醪；,甲烷(methane)发酵：复杂的有机废物发酵；,抗生素(antibiotic)发酵：淀粉糖化醪 +,豆饼粉+麸皮粉,二、发酵培养基的成分及来源 P42,碳源,氮源,无机盐和微量元素,水,生长调节物质,(,一,),、碳源,碳源功能：,为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分,为合成目的产物提供所需的碳成分,碳源,来源,葡萄糖,纯葡萄糖，水解淀粉,乳糖,纯乳糖，乳清粉,淀粉,大麦，花生粉，燕麦粉，黑麦粉，大豆粉等,蔗糖,甜菜糖蜜，甘蔗糖蜜，粗红糖，精白糖等,在微生物发酵过程中，普遍以碳水化合物作为碳源。,生产疫苗时通常用牛血清蛋白、牛肉汁等蛋白质作为碳源。,酒精、简单的有机酸、烷烃等含碳物质也可作为碳源。,甲醇作为底物生产单细胞蛋白SCP,用烷烃进行有机酸、维生素等的生产,葡萄糖：最容易利用，但过多会加快呼吸，导致溶氧缺乏、pH下降，抑制生长与产物合成,糖蜜：含糖蔗糖、氮类化合物、无机盐、维生素等，常用于丙酮丁醇生产,淀粉糊精：需经胞外酶水解后才能利用，可克服葡萄糖代谢过快的弊端，价格低廉，常用玉米淀粉、小麦淀粉、甘薯淀粉,不同的制糖工艺生产的糖液质量差异很大,不用加工方法对甘蔗糖蜜的影响,2,、油和脂肪,油、脂肪,甘油脂肪酸,CO,2,H,2,O,ATP,脂肪酶,氧气,供氧要充足，否那么会使有机酸积累，引起pH下降,常用豆油、菜油、葵花籽油、猪油、鱼油、棉籽油,3、有机酸,会使pH上升,CH3COONaO2CO2+H2O+NaOH,常用：乳酸、柠檬酸、乙酸,4、烃和醇类,正烷烃C1418)、乙醇,(,二,),、氮源,功能：,构成菌体细胞物质和含氮代谢物,氮源种类,1,、有机氮源,种类：,花生饼粉、黄豆饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体、酒糟等,特点：,菌体生长旺盛、菌丝浓度增长迅速,2,、无机氮源,种类：铵盐、硝酸盐、氨水等,可引起,pH,变化,功能：,生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物,(,三,),、无机盐及微量元素,磷酸盐,硫酸镁,钾盐,微量元素,磷是某些蛋白质和核酸的组成成分。磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。,工业上常用,K,3,PO,4,3H,2,O,、,K,3,PO,4,和,Na,2,HPO,4,12H,2,O,、,NaH,2,PO,4,2H,2,O,等磷酸盐，也可用磷酸。, 除了组成某些细胞的叶绿素成分外，并不参与任何细胞物质的合成；, 处于离子状态时，是许多重要的酶己糖磷酸化酶，柠檬酸脱氢酶、羧化酶等的激活剂；, 不但影响基质的氧化，还影响蛋白质的合成, 钾离子与细胞渗透压和透性有关；, 是许多酶的激活剂；, 促进糖代谢,四、水,发酵工厂要求恒定水源, Zn、Co、Mn、Cu等元素大局部作为酶的辅基和激活剂；, 一般作为碳、氮源的农副产品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加；, 特例：VB12的生产，由于钴是其组成成分，Co的需要量随产物的增加而增加，因此在培养基中需参加氯化钴以补充钴,五、生长调节物质,1、生长因子,广义说，但凡微生物生长不可缺少的微量有机物质都称为生长因子(又称生长素)，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等；狭义说，生长素仅指维生素。,如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子。,又如目前所使用的赖氨酸产生菌几乎都是谷氨酸产生菌的各种突变株，均为生物素缺陷型，同时也是某些氨基酸如高丝氨酸的缺陷型，需要生物素和某些氨基酸作为生长因子。,不是所有微生物都必需的，只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物质。,提供生长因子的农副产品原料,1玉米浆 corn steep liquor, CSL, 用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩液，也是玉米淀粉生产的副产品, 虽然主要用作氮源，但它含有丰富的氨基酸、核酸、维生素、无机盐等，常用作为提供生长因子的物质。,2麸皮水解液,可代替玉米浆，蛋白质、氨基酸等营养成分比玉米浆少。,用量一般为1%以干麸皮计左右,水解条件：,以干麸皮：水：,HCl=4.6:26:1,配比混合，装入水解锅中以,0.07,0.08MPa,表压加热水解,70,80min,。,以干麸皮：水,=1,：,20,，用盐酸调,pH,值,1.0,，以,0.25MPa,表压加热水解,20min,。然后过滤取滤液。,3糖蜜molasses, 甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜均可代替玉米浆，但氨基酸等有机氮含量较低, 甘蔗糖蜜用量为,0.1%,0.4%,4),酵母,酵母膏、酵母浸出液、酵母粉,5其他,牛肉膏、蛋白胨、动物心、肝等组织浸液等都含有丰富的生长因子,2、前体 P47,是指加到发酵培养基中的某些化合物，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化， 但是产物的产量却因其参加而有较大的提高。,发现：, 最早是从青霉素的生产中被发现的。, 参加玉米浆后，青霉素单位可从20U/ml增加到100U/ml；, 玉米浆中含有苯乙胺，它能被优先合成到青霉素分子中，从而提高青霉素G的产量。,发酵过程中所用的一些前体物质,产物,前体,产物,前体,青霉素,G,青霉素,V,金霉素,灰黄霉素,红霉素,苯乙酸及其衍生物,苯氧乙酸,氯化物,氯化物,正丙醇,核黄素,类胡萝卜素,L-,异亮氨酸,L-,色氨酸,L,丝氨酸,丙酸盐,紫罗酮,氨基丁酸,邻氨基苯甲酸,甘氨酸,3、产物合成促进剂,促进剂：细胞生长非必需，但参加后却能提高产量的添加剂,称为促进剂。,常用促进剂,外表活性剂洗净剂脂肪酰胺磺酸钠、吐温80聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯 、植酸等,二乙胺四乙酸EDTA,大豆油抽提物,黄血盐三水亚铁氰化钾 ，K4Fe(CN)6.3H2O ,甲醇,促进剂能促进产量增加的原因：,主要是改进了细胞的渗透性，增强了氧的传递速度，改善了菌体对氧的有效利用。,1在酶制剂发酵过程中，参加某些诱导物、外表活性剂及其他一些产酶促进剂，可以大大增加菌体的产酶量。,2抗生素工业在发酵过程中参加某些促进剂或抑制剂，常可促进抗生素的生物合成。,抗生素的抑制剂,抗生素,被抑制的产物,抑制剂,链霉素,甘露糖链霉素,甘露聚糖,去甲基链霉素,链霉素,乙硫氨酸,四环素,金霉素,溴化物、巯基苯并噻唑、硫脲嘧啶、硫脲,去甲基金霉素,金霉素,磺胺化合物、乙硫氨酸,头孢菌素,C,头孢菌素,N,L-,蛋氨酸,利福霉素,B,其他利福霉素,巴比妥药物,2抗生素工业在发酵过程中参加某些促进剂或抑制剂，常可促进抗生素的生物合成。,如：,巴比妥能够增加链霉素产生菌的抗自溶能力，到达推迟菌体自溶的目的。,聚乙烯醇可以改变发酵液的物理条件，到达改善通气效果、增加细胞渗透性的目的。,酵母厌氧发酵中参加亚硫酸盐或碱类，可以促进酒精发酵转入甘油发酵。,上节知识回忆,培养基的分类：,孢子培养基、种子培养基、发酵培养基,培养基的组成：,前体,2,培养基的设计原理及优化方法,培养基成分选择的原那么,培养基的优化,培养基设计时应注意的问题,一、培养基成分选择的原那么,1,、做好调查研究工作,2,、对生产菌种要了解,3,、做好预实验,4,、先作单因子试验，后作多因子试验,5,、注意中间补料控制,6,、,根据生产和科学研究的需要选择培养基,7,、,根据经济效益选择培养基原料,一、培养基确定方法,二、培养基成分选择的原那么 P49,1、菌体的同化能力,即一些微生物由于不能分泌一些水解酶而无法利用某些大分子物质，而只能利用小分子物质。,尤其碳源、氮源选择时要注意。,以酿酒酵母为例：一般不含淀粉酶，不能利用不可溶性淀粉；细胞内缺乏将硝酸根离子复原为铵离子的所需催化酶，所以做培养基优化时，我们用氮源时考虑各种氨盐等而少考虑各种硝酸盐类。,2、代谢的阻遏和诱导,碳氮源要注意速效和迟效的相互搭配。,1C源,葡萄糖：分解代谢物会组遏或抑制某些产物合成所需的酶系的形成或酶的活性,诱导酶制剂生产：易利用的碳源葡萄糖、果糖不利于产酶；难利用碳源淀粉、糊精对产酶有利。,2N源,微生物利用N源的能力随菌种、菌龄而已。多数能分泌胞外蛋白酶的菌株在有机氮源上可良好生长。,同一微生物处于不同生长阶段对氮源的利用能力不同。生长早期易利用铵盐、氨基氮；生长中期利用蛋白质的能力强。,蛋白酶生产受蛋白质或多肽的诱导；铵盐、硝酸盐的阻遏。,3、适宜的C、N比,1N源：过多，菌体生长旺盛，pH偏高，不,利于代谢物积累,过少，菌体繁殖量少，影响产量,2C源：过多，易造成较低的pH,过少，易引起菌体的衰老和自溶,一般工业发酵培养基的C/N1000.22.0,谷氨酸发酵C/N1001521,4、适宜的pH,利用营养物质后，酸碱物质积累或代谢酸碱物质的形成会造成培养体系pH变化,配制培养基时要充分考虑,培养基成分的含量最终都是通过实验获得的,合理的实验方法,多因子实验：均匀设计、,正交实验设计、,响应面分析等。,多因子实验,二、培养基的优化,类胡萝卜素高产菌,Y11,的培养基的优化,郭秒,食品与工业发酵，,2004,类胡萝卜素的作用：色素、营养保健,原培养基,:,初步确定可能的培养基成分,(,以碳源为例,),通过单因子实验确定适宜的培养基成分,(,以碳源为例,),考虑到本钱：乙酸钠是较为适宜的碳源,进一步：乙酸钠的浓度2%比较好,结果：,碳源：乙酸钠,0. 2%,氮源：氯化铵,0.2%,酵母膏,0.03%,无机盐,:,复合无机盐,0.05%,正交设计确定优化的配方,改进后培养基,原培养基,改进后培养基的发酵结果,正交试验设计,(Orthogonal experimental design),均匀分散，齐整可比,是一种高效率、快速、经济的实验设计方法,日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格，称为正交表,1,、 正交表的记号及含义,正交表的列数,（最多能安排的因素个数，,包括交互作用、误差等）,正交表的行数,（需要做的试验次数）,各因素的水平数,（,各因素的水平数相等）,q,正交表,的代号,如,表示,表示各因素的水平数为2，,做8次试验，最多考虑7个,因素含交互作用的正,交表。,根据正交表的数据结构看出，正交表是一个,n,行,c,列的表，其中第,j,列由数码,1,，,2,，,Sj,组成，这些数码均各出现,N/S,次，例如表,11,中，第二列的数码个数为,3,，,S,=3,，即由,1,、,2,、,3,组成，各数码均出现,3,次。,正交表的特点,1,、正交表中任意一列中，不同的数字出现的次数相等；,表示：在试验安排中，所挑选出来的水平组合是均匀分布的每个因素的各水平出现的次数相同,均衡分散性,2,、正交表中任意两列，把同行的两个数字看成有序数,对时，所有可能的数对出现的次数相同。,表示：任意两因素的各种水平的搭配在所选试验中出现的次数相等,整齐可比性,以上是设计正交试验表的根本准那么,2,、正交实验的表头设计,表头设计是正交设计的关键，它承担着将各因素及交互作用合理安排到正交表的各列中的重要任务，因此一个表头设计就是一个设计方案。,表头设计的主要步骤,(1),确定列数,(2),确定各因素的水平数,(3),选定正交表,(4),表头安排,(5),组织实施方案,整个设计过程一句话归纳为：,“因素顺序上列,水平对号入座,实验横着作。,方法1 直观分析极差分析,1计算极差，确定因素的主次顺序,第,j,列的极差,极差越大，说明这个因素的水平改变对试验结果的,影响越大，极差最大的那个因素，就是最主要的因素。,3,、结果统计方法,方法,2,方差分析法,根本思想与双因素方差分析方法一致：将总的,离差平方和分解成各因素及各交互作用的离差平方,和，构造F统计量，对各因素是否对试验指标具有,显著影响，作F检验。,确定赖氨酸产生菌,FB31,发酵培养基成分玉米浆、豆饼水解液、硫酸铵适宜浓度及其对发酵的影响,例题,表,1,正交表因子水平表,第一步：确定因子和水平，列出因子水平表,因子,水平,豆饼水解液（）,玉米浆（）,硫酸铵（）,1,2,3,0.5,1.0,1.5,2.5,3.0,3.5,3,4,5,第二步：根据因子和水平数选用适宜的正交表，,设计表头，安排试验,第三步：实验结果及分析：极差分析,表,2,正交实验结果,列号,实验号,1,2,硫酸铵,3,豆饼水解液,4,玉米浆,产酸（,g/l,）,1,2,3,4,5,6,7,8,9,1,1,1,2,2,2,3,3,3,1,2,3,1,2,3,1,2,3,1,2,3,2,3,1,3,1,2,1,2,3,3,1,2,2,3,1,21,。,0,42,。,0,31,。,0,38,。,0,22,。,0,33,。,0,24,。,0,36,。,0,30,。,0,K1,K2,K3,28,。,0,33,。,0,31,。,0,30,。,0,37,。,0,26,。,0,24,。,0,33,。,0,35,。,0,极差,5,。,0,11,。,0,11,。,0,本实验的适宜配比为：,硫酸铵,4,、豆饼水解液,1,、玉米浆,3,。,5,影响试验的因素主次为：,玉米浆豆饼水解液,硫酸铵,从直观分析图可知，进一步提高玉米浆的浓度，可能提高产酸,直观分析图,作 业,1,、某培养基影响因素与水平如下，试问应采用哪种正交表进行实验？,因素水平,玉米粉,（）,A,豆饼粉,（）,B,蛋白胨,（）,C,PH,D,1,0.5,4,0.5,5.0,2,1.0,5,0.6,5.5,3,1.5,6,0.7,6.0,如果根据正交表进行实验，结果如下：,19,、,20,、,18,、,24,、,30,、,22,、,18,、,26,、,31,，试对该结果进行分析。,2、前体,3、培养基成分在进行选择时应遵循什么原那么？,4、孢子培养基、种子培养基、发酵培养基有何不同？,为什么要灭菌？,P57,杂菌污染，使生物化学反响的基质或产物消耗，造成产率下降,杂菌产生的某些代谢产物，或染菌后发酵液的某些理化性质的改变，使产物的提取变得困难，造成,收得率降低或使产品质量下降,杂菌可能会,分解产物而使生产失败,杂菌大量繁殖，会改变反响介质的pH，从而使生化反响发生异常变化,发生,噬菌体污染,，微生物细胞被裂解而使生产失败,第四章 发酵工业的无菌技术,怎样保证纯种培养？,生产设备,灭菌并保证无泄漏,所用,培养基,必须灭菌,通入的,气体,应经除菌处理,种子,