real-time PCR

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2014/1/3,#,荧光实时,定量,PCR,Real-time PCR,报告人：余祥单,目录,定义,化学原理,数学,原理,荧光定量,PCR,如何减小,误差,引物设计要求,实验流程,基因拷贝数计算,过程,定量,PCR,仪主机的维护,问题及解决办法,A.,定义,实时,突光定量,PCR(Real-time PCR,),：,在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对,PCR,过程进行 实时监控，以此实现对,初始模板,的定量分析。,B.,如何知道基因数目的增加？,荧光信号与基因拷贝数成正比,TaqMan,探针法,每扩增一条,DNA,分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,TaqMan,探针,优缺点,优点：,1,、,对,目标序列的高特异性,2,、,设计,相对简单,3,、,重复性,比较好,缺点：,1,、,只,适合一个特定的,目标,2,、需,委托,公司标记，价格,较高,3,、,不易,找到本底低的探针,SYBR Green,SYBR Green,能结合到双链,DNA,的小沟,部位,只有,和双链,DNA,结合后才,发,出,荧光,DNA,双链,分开,就不发出,荧光,SYBR,Green,优点,及,缺点,优点,：,1,、,对,DNA,模板没有,选择性,，,适用于任何,DNA,2,、,使用方便,，,不必,设计复杂,探针,3,、,非常灵敏,；,便宜,。,缺点,：,1,、对,PCR,有,一定的,抑制作用,2,、,容易,与非特异性双链,DNA,结合，,产,生,假,阳性,（可通过溶解曲线判断非特异性扩增）,溶解曲线,C.,定量,原理,：,理想的,PCR,反应：,X=X,0,*2,n,非,理想的,PCR,反应：,X=X,0,(,1+E),n,n,：扩增反应的循环次数,X,：第,n,次循环后的产物量,X,0,：初始模板量,E,：,扩增,效率,取对数,：,logX=,n,(1+E)+logX,0,logX=n(,1+E)+,logX,0,标准曲线,绝对,定量,D.,荧光定量,PCR,如何减小误差,1,、校准,生物学,误差：内参,(,管家基因,),2,、校准,物理,误差：参,比荧光,3,、降低,随机误差,1,、校准,生物学误差内参,(,管家基因,),内参,基因,(Endogenous Control),用于,校准实验过程中样品本身对定量结果的影响,原因,：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数为单位,取,样,，提取过程中存在得率差异和操作误差，,造成,等量,样品不一定获得等量提取物,目的,：将定量结果校准为以基因组（或单个细胞）,为,单位,，不同样品之间才具有可比性,校准方法：,目的基因,/,内参,=,均一化的目的基因表达量,Master,Mix,中,ROX,浓度固定,ROX,不参与,PCR,扩增，信号强度只与,Master Mix,用量有关,ROX,的功能：校准物理误差,耗材质量、管盖厚度、透光性能,反应体系监控：蒸发、操作,2,、校准,物理误差：参比,荧光,3,、降低,随机误差,:,重复实验,生物学,重复：样品三次重复,技术,重复：每个样品做,3-4,个复孔,E.,引物,设计的要求：,Tm=55-65,GC=30-80%,PCR,扩增产物长度,：在,80-150bp,之间,引物的退火温度要高，一般要在,60,以上，,15-25,个碱,基,特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的,存在,F.,整体实验过程,扩增标准菌的目的片段,连接到质粒上，转化进大肠杆菌中扩大培养,提取质粒，计算拷贝数,将质粒稀释至少,5,个梯度，作为标准品绘制标准曲线,扩增待测样品基因片段,标准品和待测样品一起,qPCR,，通过标准品绘制的标准曲线，得到待测样品中基因的拷贝数,G.,基因拷贝数计算过程,1,、培养含有目的基因片段的质粒的大肠杆菌,2,、提取质粒，测定,OD,260,和,OD,280,纯,DNA,的,A260/A280,比值为,1.8,，纯,RNA,为,2.0,。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化,样品。,3,、,OD,260,可用于计算,DNA,的,浓度,1,A260,吸光度值,ds DNA 50 g/ml,ss,DNA 33 g/ml,ss,RNA 40 g/ml,核酸,浓度,(OD260)x(dilution factor)x 33,或,40,或,50=,ng/l,基因,拷贝数的计算：,m,M,n,V,MW,平均分子量,（,MW,）,MW,表示,1 dalton=1,g/mol,dsDNA,=,（碱基数）,（,660,道尔顿,/,碱基）,ssDNA,=,（碱基数）,（,330,道尔顿,/,碱基）,ssRNA,=,（碱基数）,（,340,道尔顿,/,碱基）,copies=,n,=,6.02,10,23,例如：,3000bp,的质粒，浓度,100 ng/l,MW=3000 bp x 660 dalton/bp =1.98 x,10,6,daltons,（,1 g/mol=1daltons,）,摩尔,数,100ng,x 10,-9,/1.98 x 10,6,copy,数 摩尔数,x 6.02 x 10,23,3x 10,10,copies/l,实验结果要求,要求,结果扩增效率大于,95%,，可决系数,R2,大于,0.98,，溶解曲线为单一峰。,H.,定量,PCR,仪主机的维护,使用,不脱毛的布块擦拭仪器表面,注意,正确的计算机和主机电源开关顺序,切勿,使用有机溶剂清洁定量,PCR,仪,防灰,除湿,定期对仪器进行校准,1,、运行,背景校准,实验,中，连续出现不正常的偏高信号，并表明可能存在荧光物质污染,时,运行,背景校准,清洁,样本块中污染的反应孔：,a.,用移液器吸取少量水或乙醇并滴入每个污染的反应孔中。,b.,吹打数次。,c.,将废液吸入废液杯中。,如,未能有效清除污染物，重复以上步骤：,乙醇三次，去离子水三次,确认,反应孔中的残留液体完全干燥,建议每月执行一次背景校准,纯荧光（,Dye,）校准,纯,荧光校准根据一系列荧光标准品收集荧光数据,软件,将不同纯荧光标准品的荧光信息分析并存储到程序中,建议每,1,年半执行,纯荧光校准,I.,实验中可能遇到的问题及解决办法,1,、八连管的购买问题，由于,ABI steponeplus,使用的是,0.1ml,的管子，并且做,qPCR,的管子都是去,Rnase,和,Dnase,的。所以比普通的管子要贵很多。,ABI,原装：八连管,￥,1,271.00,/,125,条,盖子￥,1,634.00,/300,条,Bioplastics,：,￥,800/,盒,/125,条,（包括盖子和八连管）,鼎国：￥,560/,盒,（包括盖子和八连管）,2,、荧光吸收的设置,两步法,PCR,三步法,PCR,94,30s 90,30s,94,5s 94,5s,*,60,30s 50-60,15s,*,72,15s,Program:,3min,95denaturation,PCR consisted of 40 cycles,including an 88 step for fluorescence quantification(30 s at 94,30s at 57,90s at 72and 33s at 88),followed by a 7-min extension at 72.,3,、如何保证实验一次成功,做预实验，确定标准曲线是完美的，并带一个样品，进行梯度稀释。,分析结果，确定合适的稀释倍数。然后每个样品都做普通,PCR,，以保证每个样品都能,P,出来,把有的样品,P,不出来，加,BSA,试试,4,、质粒的,OD,260,/OD,280,偏高对实验是否存在影响,OD,260,/OD,280,是,评价,DNA,的纯度的，如果质粒不纯则测,的,OD,260,计算,的质粒拷贝数就是不准确的。,谢谢！,