细胞色素C

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/10,*,细胞色素C,小组成员：潘炯琛、吕武燕、汪晨蕴、臧月梅、蔡晨、郦元,2021/10/10,1,细胞色素C,：,包括多种能够传递电子的含铁蛋白质的总称。它广泛存在于各种动物、植物组织和微生物中。细胞色素C,是,呼吸链中极重要的电子传递体,。,它主要存在于线粒体中，需氧最多的组织如心肌及酵母细胞中，细胞色素C含量丰富。,2021/10/10,2,理化性质,细胞色素C：,分子质量约为13000，蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，其中赖氨酸含量较高,，为碱性蛋白。,等电点10.2-10.8，含铁量0.37-0.43%。,易溶于水，在酸性溶液中溶解度更大，故可用酸性水溶液提取。,2021/10/10,3,理化性质,细胞色素C,的传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应，故可分为氧化性和还原性，前者水溶液呈深红色，后者水溶液呈桃红色。细胞色素C对热，酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起,部分,失活。,细胞色素C粗品是还原型和氧化型两种产品的混合物,在测定含量时,要加入联二亚硫酸钠,使混合物中的氧化型转变为还原型，还原型细胞色素C水溶液在波长520nm处有最大吸收值,。,2021/10/10,4,临床应用,细胞色素C,是一种细胞呼吸激活剂。在临床上可以纠正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状，使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常，病情得到缓解或痊愈。,如,：,一氧化碳中毒、催眠药中毒、新生儿窒息、严重休克缺氧、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难、高山缺氧、脑缺氧、心脏疾病引起的缺氧等。,2021/10/10,5,基本原理,细胞色素C,是易溶于酸性溶液,故采用酸化水提取。,人造沸石为铝酸钠，它是一种阳离子交换剂，细胞色素C分子刚好进入它的表面空隙。在pH7.5时细胞色素C呈正电荷，它可与沸石分子上的钠离子发生交换，从而被沸石吸附。,装入层析柱后，用25%硫酸铵洗脱，可将细胞色素C交换下来。硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C的亲和力。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C纯度，主要为去除杂蛋白。,另外三氯乙酸可引起细胞色素C变性和聚合，必须严格控制三氯乙酸用量。,2021/10/10,6,单击此处添加标题,匀浆,提取液,新鲜猪心,氨水、PH6、过滤,滤液,氨水PH7.2,过滤,人造沸石,水、NaCl、硫酸铵,洗脱液,硫酸铵盐析,滤液,TCA沉淀、,离心,沉淀物,蒸馏水,细胞色素C粗品溶液,硫酸、PH4,2021/10/10,7,细胞色素C的制备和测定,2021/10/10,8,材料与试剂,新鲜（冷冻）猪心样品（200g）,1mol/L H2SO4：500mL,1mol/L NH4OH：500mL,12%BaCl2：250mL,25%(NH4)2SO4：500mL,0.2%NaCl：500mL,20%三氯乙酸（TCA）：100mL,人造沸石：白色颗粒，40-60目,联二亚硫酸钠,细胞色素C标准液（3mg/ml）,2021/10/10,9,仪器,绞肉机，电磁搅拌器，离心机，分光光度计，,烧杯（,1000ml,，,500ml,，,200ml,，,50ml,各若干），,量筒，移液管，玻璃漏斗，玻璃棒，,纱布,，,滤纸,，,容量瓶,，,试管,，离心管,2021/10/10,10,步骤,步骤,1.猪心预处理与提取,2.中和,3.吸附与洗脱,4.盐析,5.TCA沉淀,6.标准曲线的制备,2021/10/10,11,1.猪心预处理与提取,。,1.,新鲜或冷冻猪心，除尽脂肪、血管和韧带，洗尽积血，切成小快，放入绞肉机中绞碎（两遍）。,2.,称取猪心碎肉200克，加,蒸馏,水300毫升,3.,用电磁搅拌器搅拌提取，再用1mol/L的硫酸调PH=4.0,，,（需要不断调整）搅拌提取,1,.5小时。用1mol/L的氨水调PH=6.0，停止搅拌。,4.,四层纱布挤压过滤，收集滤液。,2021/10/10,12,2.中和,用1mol/L的氨水调滤液PH=7.2-7.5，静置2030分钟，使沉淀沉下。,过滤除杂质，下部浑浊液离心（3000rpm,15min）。合并得到的红色清夜，测量体积。,2021/10/10,13,3.吸附与洗脱,吸附：,加10,人造沸石磁力搅拌器搅拌吸附1h蒸馏水洗3次0.2%NaCI溶液洗3次蒸馏水洗3次滤出人造沸石待用,洗脱：在柱中装人造沸石体积的三分之二蒸馏水将沸石放入柱中装满25%硫酸铵溶液进行洗脱，流速控制在2ml/min以下,收集红色的洗脱液,2021/10/10,14,4.盐析,为了进一步提纯细胞色素C，向洗脱液中缓慢加入固体硫酸铵，,（,即100ml洗脱液加17g硫酸铵）边加边搅拌，放置,30分钟,，杂蛋白沉淀析出，过滤，收集红色透亮的细胞色素C滤液，测量体积。,2021/10/10,15,5.TCA沉淀,按8%体积滴加TCA，边加边搅拌。此时细胞色素带正电荷，与其结合生成可逆沉淀析出，立即离心（3000rpm，15min）,收集沉淀（若上清液仍为红色，倒出后再补加5%体积的TCA，再次离心，收集沉淀）。沉淀用少量去离子水溶解（体积不超过10mL）。,2021/10/10,16,6.标准曲线的制备,以细胞色素C的浓度（mg/ml）为横坐标，以吸光度A520nm为纵坐标制作标准曲线，按表绘制细胞色素C含量的标准曲线,2021/10/10,17,纯度检测,因为细胞色素C属蛋白质，所以利用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测所的样品分子量大小以及纯度，从而评价所的样品的质量。具体操作：,预先配置聚丙烯酰胺凝胶，样品和标准品分别混合缓冲液点样，再点上标准屏，在恒定电压作用下，达到分离的目的。后用考马斯亮蓝染液对蛋白质进行染色，后同脱色液脱去多余染液，得到电泳图。,2021/10/10,18,