促红细胞生成素

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,基因工程,(jyn gngchng),药物促红细胞生成素（EPO）,第一页，共十八页。,EPO,的概念,EPO的,用途,及其,疗效,EPO的,纯化历,史,及,工艺流程,EPO的,销售情,情况,及其,前景,第二页，共十八页。,什么,(shn me),是EPO？,EPO：是促红细胞生成素（Erythropoietin）的英文简称。,促红细胞生成素：最初是从肾脏中分离出来能刺激前体红细胞增生、分化的一种细胞因子。,人体血液中的促红细胞生成素：是由肾脏和肝脏分泌,(fnm),的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。它与其受体(EPO-R)结合后共同介导缺氧的生理反应,。,第三页，共十八页。,EPO的用途,(yngt),医疗用途：增加红血球的数目，用于贫血、组织断离、早产儿，用在癌学和血液学方面。,体育用途(兴奋剂)：增加训练耐力和训练负荷,(fh),，属于国际奥委会规定的违禁药物。在2008年北京奥运会中第一例的兴奋剂。,第四页，共十八页。,EPO的 疗效,(lioxio),1、肾性贫血患者EPO水平较低，在进行治疗过程中，往往通过注射EPO来提高体内EPO水平进行治疗，从而帮助,(bngzh),病人增加红细胞数量，此时EPO水平有所上升。,2、其他贫血如缺铁性贫血、巨细胞性贫血患者EPO水平不降低，但也可以使用EPO治疗，此时浓度也会有所升高。,3、再生障碍性贫血和骨髓造血功能不全患者EPO水平升高。,第五页，共十八页。,EPO的纯化,(chn hu),历史,1、Miyake的七步法：纯化步骤太多，对设备及操作要求也较高，不适合工业生产的特点。,2、Spivik利用凝集素亲和层析纯化EPO：由于凝集素亲和层析凝胶易被杂蛋白不可逆吸附，使得分离效果降低，成本增高，也不利于大规模生产。,3、近年来则利用三步层析,(cn x),法三步纯化基本流程,等。,第六页，共十八页。,EPO,的工艺流程,(n y li chn),三步层析法,1、染料配基亲和层析,(cn x),反相疏水层析,(cn x),离子交换层析,(cn x),;,2、染料配基亲和层析反相疏水层析分子筛层析;,3、反相疏水层析离子交换层析分子筛层析。,第七页，共十八页。,EPO,的工艺流程,(n y li chn),三步纯化基本流程,第一步：反相柱色谱,样品浓缩,(nn su),约96.7%,透析,第二步：DEAE-离子交换色谱,第三步：分子筛色谱,总回收率 30%,比活 1.5*10,8,U/g蛋白,第八页，共十八页。,第一步：反相色谱,C6,反相柱（2cm*2cm）（创新生物技术,(jsh),公司）,流程：,上样 50ml/min,（柱结合量约5mg蛋白/ml介质),去离子水,平衡至检测基线,10%80%乙醇胍,线性梯度洗脱,检测并收集含EPO主峰,ELISA测定,结果：,60%乙醇-1mol/L盐酸胍,洗出EPO,第九页，共十八页。,透析,透析液：10倍体积的10mmol/L Tris.HCl,(pH 7.5)-2%蔗糖缓冲液,透析次数,(csh),：2,时间：56h,第十页，共十八页。,第二,步,步：,离,离子,交,交换,(l,zjiohu,n),柱,DEAE,型,型离,子,子交,换,换柱,流程,：,：,10mmol/L,Tris.HCl,(pH7.5)缓,冲,冲液,平,上样20ml/min（柱,结,结合,量,量20mg/ml,）,）,10mmol/LTris.HCl(pH7.5),缓,缓冲,液,液平,衡,衡,至基,线,线,添加NaCl,入,入缓,冲,冲液,，,，进,行,行,截状,梯,梯度,洗,洗脱,（NaCl浓,度,度,(n,ngd,),分别,为,为：50,，,，70，125mmol/L）,结果,：,：ELISA检,测,测盒,表,表明75mmol/L洗脱,峰,峰中,含,含EPO,第十,一,一页,，,，共,十,十八,页,页。,第三,步,步：,分,分子,筛,筛色,谱,谱,(s,p),SephacrylS-200,色谱,分,分析,流程,：,：,上样,体,体积,(t,j,),80ml,流速2ml/min,流动,相,相20mmol/L,柠,柠檬,酸,酸钠-100mmol/LNaCl,缓冲,液,液,结果,：,：,收集,的,的rHuEPO保,留,留时,间,间约,为,为45min,比,比,活,活性,约,约为1.5*10,8,U/g蛋,白,白；,纯,纯度,98%（SDS-PAGE,检,检测,）,）,免疫,原,原性,检,检测,：,：Westernblot,第十,二,二页,，,，共,十,十八,页,页。,EPO的,销,销售,(xioshu),情况,重组,促,促红,细,细胞,生,生成,素,素，,也,也称,超,超级,“,“重,磅,磅炸,弹,弹”,基,基因,药,药物,。,。,1985,年,年科,学,学家,应,应用,基,基因,重,重组,技,技术,，,，在,实,实验,室,室获,得,得重,组,组人EPO（rhEPO）,，,，1989年,安,安进,（,（Amgen,）,）公,司,司的,第,第一,个,个基,因,因重,组,组药,物,物Epogen获,得,得FDA,的,的批,准,准，,适,适应,症,症为,慢,慢性,肾,肾功,能,能衰,竭,竭导,致,致的,贫,贫血,、,、恶,性,性肿,瘤,瘤或,化,化疗,导,导致,的,的贫,血,血、,失,失血,后,后贫,血,血等,，,，其,市,市场,(shch,ng),表现,不,不俗,，,，1999年,销,销售,值,值达,到,到17.6亿,美,美元,，,，2000年19.6,亿,亿美,元,元，2002,年,年22.6亿,美,美元,，,，2003年24.4,亿,亿美,元,元，,成,成为,名,名副,其,其实,的,的“,重,重磅,炸,炸弹,”,”基,因,因药,物,物。,第十三页,，,，共十八,页,页。,安进（Amgen,）,）开发的,用,用于治疗,恶,恶性贫血,症,症的第二,代,代促红细,胞,胞生成素,新,新产品Arnesp2001年得到FDA的,批,批准，Arnesp2002年初正,式,式,(zhngsh,),上市。,Arnesp：是,一,一种“高,糖,糖基化”,促,促红素产,品,品。其促,进,进红细胞,生,生成的能,力,力大大优,于,于第一代EPO（,促,促红细胞,生,生成素）,产,产品。第,一,一年上市,即,即大获全,胜,胜，赢得,开,开们红，Arnesp2002年全,年,年销售额,为,为4.2,亿,亿美元，2003,年,年全年销,售,售额为15.4亿,美,美元。,估计在今,后,后3年内,，,，Arnesp将,创,创造10,亿,亿15,亿,亿美元的,市,市场销售,额,额并夺取,现,现有EPO生产商,的,的部分市,场,场，其市,场,场前景不,可,可估量。,第十四页,，,，共十八,页,页。,2001,年,年，EPO（包括,(boku),Arnesp）的,全,全球销售,额,额达21.1亿美,元,元，2002年达26.8,亿,亿美元，2003,年,年全世界EPO的,年,年销售额,超,超过50,亿,亿美元。,创,创下生物,工,工程药品,单,单个品种,之,之最，是,当,当今最成,功,功的基因,工,工程药物,。,。,强生（Johnson&Johnson）公,司,司的促红,细,细胞生成,素,素Procrit/Eprex更是,表,表现不俗,，,，2001年销售,额,额34.42亿美,元,元，2002年销,售,售额42.69亿,美,美元，2003,年,年销售收,入,入达到39.84,亿,亿美元。,第十五页,，,，共十八,页,页。,目前，国,内,内已有10多家单,位,位获准生,产,产红细胞,生,生成素。,沈,沈阳三生,和,和上海麒,麟,麟鲲鹏（,中,中国）生,物,物药业的,产,产品在国,内,内医院的,销,销售额独,领,领风骚，2001,年,年EPO,的,的国内医,院,院销售总,额,额约为47449,万,万元，2002年,为,为49508万元,，,，2003年上半,年,年为28606万,元,元。,估计国内,的,的年市场,容,容量在20到30,亿,亿元左右,，,，但目前,年,年销售额,只,只有区区,(qq,),5亿元左,右,右。,综上所,述,述，EPO的,市,市场前,景,景非常,可,可观,。,EPO,的,的市场,前,前景,第十六,页,页，共,十,十八页,。,。,THANKYOU!,第十七,页,页，共,十,十八页,。,。,内容,(nirng),总结,基因工,程,程药物,促,促红细,胞,胞生成,素,素（EPO）,。,。基因,工,工程药,物,物,促红,细,细胞生,成,成素（EPO,）,）。3,、,、近年,来,来则利,用,用三步,层,层析法,三,三步纯,化,化基本,流,流程,(li,ch,ng),。EPO的工,艺,艺流程,(li,ch,ng),三,三步层,析,析法。EPO,的,的工艺,流,流程,(li,ch,ng),三,三步纯,化,化基本,流,流程,(li,ch,ng),。THANKYOU,第十八,页,页，共,十,十八页,。,。,