《质粒的酶切》PPT课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,质粒的酶切,酶切片段的回收,酶切片段的连接,亚克隆流程示意,关于限制性内切酶,1.,定义：识别双链,DNA,分子核苷酸序列,并加以切开,2.,来源：细菌的限制修饰系统,3.,特性：识别,4 6,个核苷酸序列,产生平端和粘端,4.,应用：定点切割,酶切产生的末端,（,1,）,G A T,A T C,C T A,T A G,EcoR,酶切产生平端,G A T,P,A T C,C T A,P,T A G,（,2,）,G,A A T T C,C T T A A,G,EcoR,酶切产生,5,突出粘端,G,P,A A T T C,C T T A A,P,G,(3,）,C T G C A,G,G,A C G T C,Pst,酶切产生,3,突出粘端,C T G C A,P,G,G,P,A C G T C,限制性内切酶的定义、命名,1.,定义,：,广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指,II,型限制酶。,2.,命名,：,限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。,例如：,Hin,d,前三个字母来自于菌种名称,H.,in,fluenzae,，“,”表示菌系为型血清型；“,”,表示分离到的第三个限制酶。,Eco,RI,E,scherichia,co,li,RI,Hin,d,H,aemophilus,in,fluensae,d,Sac,I,(II),S,treptomyces,ac,hromagenes,I,(,),酶切反应,限制性内切酶反应一般在灭菌的,0.5ml,离心管中进行。,20l,体积反应体系如下：,A:,质粒（,pGEM-1808,或,pET21a,）,0.5g,B:10,酶切,buffer 2.0l,C:Hind 0.5l,D:,EcoR,0.5l,E:,加,ddH,2,O,至,20l,37,水浴消化,1,小时。,酶切示意图,EcoR,EcoR,EcoR,EcoR,pGEM,-NGF,NGF,NGF,酶切,pGEM,载体,EcoR,EcoR,质粒的酶切电泳,琼脂糖冻融法回收、纯化,DNA,片段,1.,在紫外灯下仔细切下含所需,DNA,片段的胶条（小于,0.6g,）,捣碎，置于,1.5ml,离心管中。,2.,加入等体积的,Tris-Cl,饱和酚（,pH 7.6,），,振荡混匀；,-20,放置,5-10min,待结冻；,3.10000rpm5min,，,上层液转移置另一离心管中；,4.,原管加入,1/4,体积,H,2,O,于含胶的离心管中，振荡混匀；,-20,放置,5-10min,待结冻；,5.10000rpm5min,，,合并上清液；,6.,用等体积酚,/,氯仿抽提,2,次、氯仿抽提,1,次，,取上清于新微量离心管；,7.,加入,1/10,体积,3M,NaAc,（,pH 5.2,），,2.5,倍体积预冷的,无水乙醇，,-20,，放置,30min,（,或过夜）；,8.13000rpm10min,，,弃上清；,75%,乙醇洗沉淀,1-2,次，晾干；,9.,适量,H,2,O,或,TE,溶解；电泳检测。,关于连接酶,定义：,ATP,存在下，在,3OH,和,5 P,之,间形成磷酸二酯键。,特性：连接粘端的效率远高于平端。,策略：,1.,首选不匹配粘端,2.,次选匹配粘端，载体脱磷,3.,平端连接，提高酶量,不匹配粘端连接图示,匹配粘端连接图示,平端连接图示,DNA,片段的连接反应,连接反应一般在灭菌的,0.5ml,离心管中进行,1.10l,体积反应体系中：取载体,50-100ng,，,加入一,定比例的外源,DNA,分子（一般线性载体,DNA,分子与外源,DNA,分子摩尔数为,11-15,），补,ddH,2,O,至,8l,。,2.,轻轻混匀，稍加离心，置,56 5min,，,迅速转入冰浴。,4.,加入含,ATP,的,10Buffer 1l,。,5.T4 DNA,连接酶,1l,。,6.,稍加离心,14-16,连接,8-14hr,。,T-A,连接,NGF,NGF,PCR,产物,A,A,T,T,pGEM,-T,pGEM,-NGF,连接,连接产物的蓝白斑鉴定,