色谱分析法导论课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九章 色谱法,石化系 分析教研室,1,主要内容：,第一节 色谱法概述,第二节 气相色谱法,第三节 高效液相色谱法,2,一、,色谱法的来源,色谱法,(chromatography),早在,1903,年由俄国植物学家茨维特最先发明并定义，他在研究植物叶子的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有,碳酸钙,的直立玻璃管内，然后加入,石油醚,使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种,不同颜色的谱带,。他称之为,色谱,。这种方法因此得名为色谱法，又称层析法。以后此法逐渐应用于无色物质的,分离分析,。,第一节 色谱法概述,3,色谱分离过程,4,二、色谱分离的原理,当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。,两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础,5,三、,色谱法分类,6,第二节 气相色谱法（,GC,）,一、气相色谱的概念、分类、原理和特点,二、气相色谱仪,三、色谱常用术语,四、气相色谱的应用,7,一、,GC,的概念、分类、原理和特点,1.,概念：,GC,法是采用气体为流动相（载气）流经色谱柱进行分离测定的色谱方法。,2.,分类,：,气,-,液色谱和气,-,固色谱,填充气相色谱,毛细管柱气相色谱,气,-,固色谱,气相色谱,气液分配色谱,8,3.,原理：被测样品在和固定液的接触过程中，发生多次溶解,-,挥发过程。不同的组分，在固定液中溶解性能不同，因此出柱的时间不一，各组分彼此分开。,载气,A+B,A,B,A,B,检测,器,A,B,9,4.,特点,应用范围广,分离效率高，分析速度快,样品用量少， 灵敏度高,选择性好,5,、应用范围：,分析对热稳定，具有一定挥发性的样品。,10,二、气相色谱仪,11,（一）气相色谱仪的构成,气路系统,进样系统,分离系统,检测系统,温控系统,12,13,1.,气路系统,作用,：,获得纯净、流速稳定的载气。包括气源、压力计、流量计及气体净化装置等。,常用的载气,：,H,2,、,He,、,N,2,、,Ar,载气的要求：化学惰性，不与有关物质反应。载气的选择除了要求考虑对柱效的影响外，还要与分析对象和所用的检测器相匹配。,载气的来源：,气体钢瓶和减压阀：压力表多为两级压力指示,气体发生器：氮气、氢气、空气及一体机,14,15,2.,进样系统,构成：,进样器、进样口、气化室等,要求：,进样量或体积要适宜、准确；,采用常规色谱柱分离，进样体积几至几十微升；,对毛细管柱分离，体积约为,10,-2,10,-3,L,；,体积过大或进样过慢，将导致分离变差（拖尾）；,进样针最大容量与进样量要匹配。,汽化室要求：体积小；热容量大；,对样品无催化作用,16,包括：填充柱和毛细管柱,3.,分离系统,填充柱：多为,U,形或螺旋形；内填固定相。,毛细管柱：分为涂壁、多孔层和涂载体开管柱，内径,0.1,0.5mm,，长达几十至,100m,，通常弯成直径,10,30cm,的螺旋状；其特点为渗透性好、传质快，分离效率高（,n,可达,10,6,）、分析速度快、样品量小。,色谱柱：,U,型或螺旋型金属管（,内径,2,6mm,，长,1,3m,）、,固定液、,载体（担体）,组成。,17,作用对象：气化室、柱箱、检测器,控温方式：恒温和程序升温,4.,温控系统,18,作用：将经色谱柱分离后顺序流出的化学组分的信息转变为便于纪录的电信号，然后对被分离物质的组成和含量进行鉴定和测量。,常用的检测器：,氢火焰离子化检测器,热导池检测器,电子捕获检测器,(ECD,质谱检测器,5.,检测系统,19,氢火焰离子化检测器（,FID,）,有机碳专用检测器,燃气,H,2,O,2,（空气）,高温,有机物,电离,离子室,CH,3,CH,2,CH,3,nCH,3,+ne,收集极,发射极,ISOV,直流电压,正负离子向电极移动,产生电流，经放大记录，信号大小与进入火焰的碳原子数有关。,特点：,灵敏度高，线性范围广，专属性检测器，样品被破坏。,质量型检测器,20,热导池检测器（,TCD,）,通用检测器,参比臂（通入载气）,测量臂（通入来自色谱柱气）,特点：,结构简单、测量范围广、,热稳定性好线性范围宽、,样品不被破坏,缺点：灵敏度低。,浓度型检测器,21,电子捕获检测器,(ECD),主要对含有较大电负性原子的化合物响应（如卤素、硫、磷、氮、氧）。它特别适合于环境样品中卤代农药和多氯联苯等微量污染物的分析。,质谱检测器,(MSD),即气相色谱,质谱联用仪,(GC-MS),质谱是唯一可以给出分子量,确定分子式的方法,而分子式的确定对化合物的结构鉴定是至关重要的。,22,三、色谱常用术语,（一）色谱图,混合物样品（,A+B）,色谱柱中分离检测器记录下来。组分从色谱柱流出时，各个组分在检测器上所产生的,信号,随,时间,变化，所形成的曲线叫色谱图。,记录了各个组分流出色谱柱的情况，又叫色谱流出曲线。,23,1.,基线,在实验操作条件下，色谱柱后没有组分流出的曲线叫基线。,稳定情况下是一条直线,基线上下波动称为噪音,24,2.,色谱峰的高度（,峰高，,h,）,色谱峰最高点与基线之间的距离,峰高低与组分浓度有关，峰越高越窄越好,h,25,3.,色谱峰的宽度,(,区域宽度,),标准偏差,峰高0.607倍处的色谱峰宽的一半。,峰底宽,W,b,色谱峰两侧拐点所作切线在基线上的距离,W,b,=4,半峰宽,W,1/2,峰高一半处色谱峰的宽度,W,1/2,=2 .354,W,b,=4,W,1/2,=0.589W,b,W,b,W,1/2,26,4.,色谱峰面积（,A,）,色谱峰与峰底所围的面积。,对于对称的色谱峰,A=1.065h W,1/2,对于非对称的色谱峰,A=1.065h(W,0.15,+W,0.85,)/2,27,5.,死时间,t,0,不被固定相吸附或溶解的组分流经色谱柱所需时间,从进样开始到柱后出现峰最大值所需时间,气相色谱,惰性气体（空气、甲烷等）流出色谱柱所需时间,t,0,28,6.,保留时间,t,R,组分流经色谱柱时所需时间。,进样开始到柱后出现最大值时所需的时间,操作条件不变时，一种组分有一个,t,R,定值,定性参数,29,7.,调整保留时间,t,R,扣除了死时间的保留时间，又称校正保留时间，实际保留时间。,t,R,=t,R,-t,0,体现的是组分在柱中被吸附或溶解的时间。,t,R,30,色谱保留值,定性的依据,组分在色谱柱中停留的数值，,可用时间,t,来表示。,组分在固定相中溶解性能越好，或固定相的吸附性越强，在柱中滞留的时间越长，消耗的流动相体积越大。,固定相、流动相固定，条件一定时，组分的保留值是个定值。,t,0,与被测组分无关，因而,t,R,更合理地反映了物质在柱中的保留情况。,31,根据色谱图可得到的重要信息：,（1）,色谱峰个数,判断样品中所含组分的最少个数,（2）,色谱峰的位置即保留值,进行定性分析,（,3,）,色谱峰的,h,、,A,进行定量分析,（,4,）,色谱峰的位置及峰的宽度,可评价色谱柱效（分离效能）,（,5,）,色谱峰两峰间的距离,可评价固定相或流动相选择是否合适,32,四、气相色谱的应用,一、定性分析,定性分析的任务是确定色谱图上各个峰代表什么物质。,1.利用保留值与已知物对照定性,（1）利用保留时间定性,在相同色谱条件下，将标准物和样品分别进样，两者保留值相同，可能为同一物质。,此方法要求操作条件稳定、一致，必须严格控制操作条件，尤其是流速。,33,34,（2）利用峰高增量定性,若样品复杂，流出峰距离太近，或操作条件不易控制，可将已知物加到样品中，混合进样，若被测组分峰高增加了，则可能含该已知物。,（3）利用双色谱系统定性,通过改变色谱条件来改变分离选择性，使不同物质显示不同保留值。例：,选用极性差别较大的两种不同固定液来制备色谱柱，不同物质具有不同保留值,35,二、定量分析,气相色谱定量分析是根据检测器对溶质产生的,响应信号与溶质的量成正比的原理,，通过色谱图上的峰面积或峰高，计算样品中溶质的含量。,m,i,=f,i,A,i,m,i,=f,i,h,i,m,i,被测组分,i,的质量，,f,i,比例系数,A,i,、h,i,被测组分的峰面积及峰高,36,2、定量方法,（1）归一化法,试样各组分都出峰,，可用归一化法定量。,把所有出峰组分的含量之和当作100%的定量分析方法称为归一化法。,若样品中有几个组分，每个组分的量分解为,m,1,m,2,m,n,，,各组分含量总和为,m,，,则组分的质量为,m,i,质量分数,W,i,为,37,优点：简便、准确、不需标准物，不必准确称量和准确进样，操作条件稍有变化对结果影响较少。,38,（2）内标法,准确称取样品,m（,含,m,i,被测组分）,+准确称取纯物质作内标物,m,s,混合物进样,被测组分,标样（内标物）,39,s,s,i,i,s,i,A,f,A,f,m,m,=,s,s,i,i,s,i,A,f,A,f,m,m,=,40,对内标物的要求：,1）内标物应是样品中不存在的纯物质。,2）内标物与被测物的峰尽量靠近，但又能完全分开，,t,R,相差少。,优点：,定量准确，操作条件不必严格控制，与进样量无关，被测组分和内标物出峰即可，适用于微量组分的测定，应用广泛。,缺点：,每次测定都要准确称量样品和内标物。,41,（3）外标法标准曲线法,当样品中各组分不能完全流出，又没有合适内标物时，可采用此法。,将待测组分的纯物质配制不同浓度的标准系列，在相同操作条件下，定量进样，测各个峰的,A,或,h ，,绘制,A,C,曲线或,h,C,曲线。,42,在完全相同条件下，测待测样品，根据,A,待,或,h,待,，从曲线上查出待测组分含量。,优点：,操作简单，计算方便，不用,f,i,。,缺点：,要求准确进样，操作条件稳定。,A(h),C,A,待,C,待,43,一、,HPLC,的概念、分类、特点及应用,1.,概念：,HPLC,系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。,2.,分类：根据分离机制不同，分为：,第三节 高效液相色谱法,(HPLC),液固吸附色谱,液液分配色谱,化学键合色谱,离子交换色谱,44,利用保留值作为定性参数；,利用在样品中加入对照品，通过峰值增高来确认；,利用,LC-MS,联用仪，通过被分离物的质谱图与谱,库的谱图对比来定性。,4.,应用,高速、高效、高灵敏度、应用广泛（,GC,分析只占,有机物的,20%,，,HPLC,分析可占,80%,）,3.,特点,45,二、高效液相色谱仪,输液系统,进样系统,分离系统,检测系统,46,47,其,工作过程,如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入,色谱柱,，然后从控制器的出口流出。当注入欲,分离样品,时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入,检测器,，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。,48,1.,输液系统,高压输液泵,恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵,双泵：为了克服流量的脉动。有串联式和并联式,输液泵应具备的性能：,流量精度高且稳定,流量范围宽,能在高压下连续工作,液缸容积小,密封性能好，耐腐蚀,49,输液泵操作注意事项：,防止固体微粒进入泵体,流动相不应含有腐蚀性物质,防止溶剂瓶内的流动相被用完,不超过规定的最高压力,流动相一般应该先脱气,50,2.,进样系统,进样器,进样阀（六通阀）、自动进样装置,色谱柱（,column,）,由柱管和固定相组成,分析柱、制备柱,51,六通阀进样,进样系统,52,3.,分离系统,分离系统的主要元件是色谱柱，它是色谱分离过程中存放固定相的场所 。,53,4.,检测系统,（,1,）检测器,(detector),的主要性能,要求：,灵敏度（,sensitivity,）高（检测限低）,噪音（,noise,）低,线性范围（,linear range,）宽,重复性（,repeatability,）好,适用范围广（通用型、专属型）,54,（,2,）紫外检测器,(ultraviolet detector),检测原理：,朗伯比尔,(Lambert-Beer),定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比,A,=,Cl,特点：,灵敏度较高（,10,-6,10,-9,g/ml,），噪音低，线性范围宽，稳定性好，不破坏样品，应用广泛（分析、制备）。,局限：,只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小于检测波长。,55,分类：,固定波长检测器 ：,254nm,可变波长检测器：,光源：氘灯（和钨灯），,200,400,（,800,）,nm,，单色器，流通池（试样），光电,管,光路系统和紫外分光光度计相似,光电二极管阵列检测器,(photodiode array detector,；,PDAD),：,一系列光电二极管，,一个二极管对应接受光谱上约,1nm,谱带宽的单色光,56,（,3,）光电二极管阵列检测器,工作原理：复光通过流通池，再进入单色器，分光后照射在二极管阵列装置上，同时获得各波长的信号强度，即获得组分的吸收光谱。获得三维光谱色谱图。,用途：吸收光谱用于组分的定性，色谱峰面积用于定量,判断峰纯度。,57,光电二极管阵列检测器,58,