核酸的物化性质

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,核酸的一般物理性质,DNA,为白色纤维状固体，,RNA,为白色粉末状固体，都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂,。,（用乙醇从溶液中沉淀核酸）,DNA,和,RNA,在细胞中常以核蛋白形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。,DNA,核蛋白,RNA,核蛋白,0.14,mol/LNaCl -+,1-2mol/LNaCl +-,DNA,溶液的粘度很大，而,RNA,溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。,核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。,第14章 核酸的理化性质,一、核酸的水解,核酸分子中的,N-,糖苷键,和,磷酸酯键,都可被水解。,（一）,核酸的酸解,糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解，,水解的难易顺序为：磷酸酯键糖苷键,嘧啶碱的糖苷键嘌呤碱的糖苷键,嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键最易水解。,如，,DNA,在,pH 1.6,于37对水透析即可完全除去嘌呤碱，。,嘧啶糖苷键的水解常需要较高的温度。用甲酸（98-100%）密封加热至 175,2h，,无论,RNA,或,DNA,都可以完全水解，产生嘌呤和嘧啶碱。,（二）,核酸的碱解,常用的碱有,NaOH,、KOH,等，主要水解磷酸酯键。以,KOH,效果最好。,RNA,较易被碱水解。,例如，在0.3-1,mol/L,NaOH,溶液中，在室温至37,0,C,条件下,RNA,几乎可以完全水解，生成,2-或3-核苷酸,，还可能有少量的核苷、2,5-或3,5-核苷二磷酸,。,DNA,在较难被碱水解。,DNA,在1,mol/L,NaOH,溶液中，加温至100,0,C，4,个小时也可得到小分子的,寡聚脱氧核苷酸,。,这种水解性能上的差别，与,RNA,核糖基上2-,OH,参与作用有很大的关系。在,RNA,水解时，2-,OH,首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。,（三）核酸的酶解,核糖核酸酶,T,2,（RNase T,2,）。,这个酶的来源同,RNase T,1,，,主要作用,点为,Ap,残基，可以将,tRNA,完全降解成,3-,腺苷酸结尾的寡核苷酸。,牛脾核糖核酸酶的作用位点,核糖核酸酶,T,1,的作用位点,链球菌脱氧核糖核酸酶，是一个内切酶，作用于,DNA,产,物为5-磷酸为末端的碎片，其长度不一。,限制性内切酶，在细菌中发现有这类酶，主要是降解外,源的,DNA。,具有很严格的碱基序列专一性，是基因工程最,重要的工具酶。,三、核酸的紫外吸收,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240-290,nm,之间有强吸收峰，在260,nm,左右有最大吸收峰。可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据。,对于纯的,DNA,或,RNA，,可测定,A,260,双螺旋,DNA,含量（,g/mL）=A,260,50,单链,DNA,含量（,g/mL）=A,260,40,寡核苷酸含量（,g/mL）=A,260,20,纯度的判断：测定,A,260,/A,280,的比值，纯,DNA,比值1.8,纯,RNA,比值2.0,有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷的吸光度来表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。据此先测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出,摩尔磷吸光系数,（P）,。,增色效应,当双链核酸变性转变为单链核酸时，其在260,nm,的紫外吸收值增加，,（P）,值也升高，这种现象称为增色效应。,减色效应,当单链核酸复性转变为双链核酸时，其在260,nm,的紫外吸收值减少，,（P）,值也降低，这种现象称为减色效应。,四核酸的变性、复性与杂交,（一）核酸的变性（,denaturation）,核酸的变性指核酸双螺旋区的碱基之间的氢键断裂，变成单链的过程。,能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。,RNA,本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有,DNA,那样明显。,利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。,因为天然状态的,DNA,在完全变性后，紫外吸收(260,nm),值增加2540%.而,RNA,变性后，约增加1.1%。,A,260,值增加,粘度下降,浮力密度增大,分子量不变,DNA,变性后的表现,DNA,的热,变性和解链温度（,Tm,）,用加热的方法使核酸变性叫做,热变性。,DNA,的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，,通常把加热变性使,DNA,的双螺旋结构失去一半时的温度称为,DNA,熔解温度或熔点，用,T,m,表示。,一般,DNA,的,T,m,值在82-95,C,之间。,RNA,的,T m,值,tRNA,的,T m,值,DNA,T,m,的影响因素：,（1）DNA,的均一性。,均质,DNA，,如一些病毒,DNA，,人工合成的,poly(A-T)、poly(G-C),的熔解过程发生在一个较小的温度范围内；异质,DNA,的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内。,Tm,大小可反映出,DNA,的均一性。,（2）G,-,C,的含量。,G,-,C,的含量高，,T,m,值高,。因而测定,Tm,值，可反映,DNA,分子中,G、C,含量，可通过经验公式计算：,（,G+C)%=(Tm-69.3),2.44,（3）,介质中的离子强度。,Tm,与介质中离子强度有关，一般来说，在离子强度低的介质中，,DNA,的,T,m,值较低，,熔解的范围较宽。在离子强度高的介质中，,DNA,的,T,m,值较高，,熔解的范围较窄。,DNA,的保存应在含盐的缓冲液中,RNA,的变性,（二）核酸的复性,变性,DNA,在适当的条件下,，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为,复性,。,DNA,复性后，一系列物理、化学性质将得到恢复。,DNA,复性的程度、速率与复性过程的条件有关。,将热变性的,DNA,骤然冷却至低温时，,DNA,不可能复性。,但是将变性的,DNA,缓慢冷却时，可以复性，这一过程也叫退火（,annealing),。,分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，,DNA,的复性也与它本身的组成和结构有关。,复性反应的速度用,Cot,1/2,表示。,Co,为变性,DNA,复性时的浓度，,t,为时间，以秒表示。,DNA,复性,（三）核酸的杂交,（,hybridization）,热变性的,DNA,单链，在复性时并不一定与同源,DNA,互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源,DNA,单链形成双螺旋结构。,这样形成的新分子称为杂交,DNA,分子。,DNA,单链与互补的,RNA,链之间也可以发生杂交。,核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。,Southern blotting(Southern,印迹),Northern blotting(Northern,印迹),Western blotting(Western,印迹),第15章 核酸的研究方法,一、核酸的分离、提纯和定量,（一,）DNA,的分离,1、,染色体,DNA,与碱性蛋白（组蛋白）结合成的核蛋白（,DNP）,沉淀,真核细胞,破碎,1,mol/L,氯化钠提取,稀释至0.14,mol/L,加水饱和的苯酚，振荡,冷冻离心,水相（含,DNA）,酚相（含蛋白质）,加2倍体积冷乙醇,纯,DNA,2、用氯仿-辛醇（或异戊醇）代替苯酚，方法同1,65保温4,h,真核细胞悬液,加入2倍体积含1%,SDS,的缓冲液和广谱蛋白酶,加苯酚抽提,分离,水相（含,DNA,和少量,RNA）,酚相（含蛋白质和酶）,加,RNA,酶,纯,DNA,3、,4、氯化铯密度梯度离心,（二）,（三）,