细胞培养周l课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞培养基本知识,合适的环境和必需的条件,1,营养需要,2,环 境 要 求,3,无毒及无污染,环境要求,实验室：,基础实验室一级生物安全水平、,基础实验室二级生物安全水平、,防护实验室三级生物安全水平,最高防护实验室四级生物安全水平,有关手册有相关叙述：,与各危险度等级微生物相对应,实验室生物安全水平,1级基础实验室,一级生物安全水平 基础的教学、研究,GMT不需要；开放实验台,2级基础实验室,二 级生物安全水平 初级卫生服务；诊断、研究；GMT加防护服、生物危害标志 开放实验台，此外需 BSC用于防护可能生成的气溶胶,BSC：生物安全柜；,GMT：微生物学操作技术规范,典型的二级生物安全水平实验室,门保持关闭并贴上适当的危险标志。,潜在被污染的废弃物同普通废弃物隔开。,基本生物安全设备 1.移液辅助器避免用口吸的方式移液,2.生物安全柜，在以下情况使用：处理感染性物质；如果使用密封的安全离心杯，并在生物安全柜内装样、取样，则这类材料可在开放实验室离心 进行极有可能产生气溶胶的操作时（离心、研磨、混匀、剧烈摇动、超声破碎、打开内部压力和周围环境压力不同的盛放有感染性物质的容器、动物鼻腔接种以及从动物或卵胚采集感染性组织）。3.一次性塑料接种环；也可在生物安全柜内使用电加热接种环，以减少生成气溶胶。4.螺口盖试管及瓶子。5.用于清除感染性材料污染的高压灭菌器或其他适当工具。6.一次性巴斯德塑料移液管，尽量避免使用玻璃制品。7.在投入使用前，像高压灭菌器和生物安全柜等设备必须用正确方法进行验收。应参照生产商的说明书定期检测。,3级防护实验室,三 级生物安全水平 特殊的诊断、研 究，在二级生物安全防护水平上增加特殊防护服、进入制度、定向气流BSC和或其他所有实验室工作所需要的基本设备,4级最高防护实验室,四级生物安全水平 危险病原体研究在三级生物安全防护水平上,增加,气锁入口、出 口淋浴、污染物品的特殊处理 级BSC或级BSC。穿着正压服、双开门高压灭菌器（穿过墙体）、经过滤的空气。,传染病原危害等级。,第一级危害群微生物：,与人类成人健康和疾病无关；（无或极低的个体和群体危险）不太可能引起人或动物致病的微生物,第二级危害群微生物：,在人类所引起的疾病很少是严重的，而且通常有预防及治疗的方法；（个体危险中等，群体危险低）实验室暴露也许会引起严重感染，但对感染有有效的预防和治疗措施，并且疾病传播的危险有限。,第三级危害群微生物：,在人类可以引起严重或致死的疾病，可能有预防和治疗方法；,第四级危害群微生物：,在人类可以引起严重或致死的疾病，通常无预防和治疗的方法，如炭疽杆菌、霍乱弧菌、埃博拉病毒、天花病毒等。,无 毒：,无毒是培养细胞的必需条件。凡与,细胞直接或间接接触的东西都必须,是无毒的。,无,污染,微生物的污染,不同细胞类型的交叉污染,细菌,霉菌,支原体,等,废弃物处理,首要原则：,所有感染性材料必须在实验室内清除污染、高压灭菌或焚烧。,处理潜在感染性微生物或动物组织的所有的实验室物品，在被丢弃前应考虑的,主要问题,有：1.是否已采取规定程序对该物品进行了有效的清除污染或消毒？2.丢弃已清除污染的物品时，是否会对直接参与丢弃的人员，或在设施外可能接触到丢弃物的人员造成任何潜在的生物学或其他方面的危害？3.清除污染 高压蒸汽灭菌是清除污染时的首选方法。,需要清除污染并丢弃的物品应装在容器中。任何高压灭菌后重复使用的污染（有潜在感染性）材料不应事先清洗，任何必要的清洗、修复必须在高压灭菌或消毒后进行。,也可采用其他除去或杀灭微生物的替代方法 4.污染性材料和废弃物的处理和丢弃程序 相关工作要遵守国家和国际规定。,实验设备及用品：,超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸,CO,2,培养箱,倒置显微镜,酶标仪、微孔板震荡器,液氮,罐,自动双重纯水蒸馏器，纯水仪,耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管,CO,2,培养箱,倒置像差生物显微镜,超净工作台,生物安全柜,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,滤 器,培 养 板 及瓶,实验准备,清洗,在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长,微生物产品附带杂物,上次细胞残留物,非营养成分的化学物质,需要清洗的培养用品,玻璃器皿的清洗,胶塞的清洗,塑料制品的清洗,玻璃器皿的清洗基本方法,经典方法：,浸泡、刷洗、浸酸,和,冲洗,浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、流水冲洗、60烘干、酸泡（24小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、60烘干,清洗后的玻璃器皿：干净透明无油迹，无残留物质,刷洗：,用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质,刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度,浸酸,：,玻璃器皿浸泡到清洁液中,清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质,浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面,浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时,清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）,强清洁液 631000200,次强清洗液 120 2001000,弱清洁液 100 1001000,配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分,配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色,冲洗,在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹,最好用洗涤装置,如用手工操作,需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5 次，晾干备用,胶塞的清洗,新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理,常规清洗方法,每次用后立即置入水中浸泡，用2%NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用,塑料制品的清洗,塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品,必要时用2%NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用,本实验：,自来水洗,蒸馏水洗,甩干水,干燥,装盒,消毒。,消毒,细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染,常见原因：,操作间或周围空间的不洁,培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底,由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染,消毒灭菌方法,物理消毒灭菌法,紫外线：,用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，30min,湿热（高压蒸气灭菌法）：,121，20min,干烤：160,2 小时,过滤：0.22,m,化学消毒灭菌法,70%酒精,主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理,1新洁尔灭,主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒,抗生素,主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染,细胞培养基应用选择,参考：,(1）建立某种细胞株所用的培养基应是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。,(2)其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。,(3)根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选 RPMI1640。,(4)用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。,常用的培养基种类,RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、,DMEM-低糖（标准型）、McCoys 5A、M199、F10等,制备1000ml RPMI1640培养基,RPMI1640干粉培养基10.4g（1包）三蒸馏水400ml 磁力搅拌至完全溶解 加三蒸馏水定容至1000ml 在超净台内无菌条件下，用灭菌后的并置有 0.22m 孔径滤膜的过滤器除菌，分装200ml/瓶，-20保存备用。,用前取一瓶溶解，每200ml培养液加灭活的小牛血清至终浓度为10%，即加22ml。加青霉素和链霉素至终浓度各为100U/ml。-,细胞培养液,消化液,分离组织和分散细胞,常用：胰蛋白酶、二乙胺四乙酸二钠(EDTA),单独或混合使用,胰蛋白酶溶液,：,胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。,胰蛋白酶液浓度,越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。,胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。,用含血清培养液终止其对细胞的消化作用,胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许,D-Hanks 平衡盐,溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平衡盐溶液（,常用浓度为0.25%（0.1%-0.5%）,）搅拌混匀，置室温 4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振荡,次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，,-20保存备用,（以免分解失效），,胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可用碳酸氢钠溶液调,pH 至7.2 左右,胰蛋白酶溶液配制,D-Hanks 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions,D-HBSS),KCl,0.40g,KH2PO4,0.06g,NaCl,8.00g,NaCO3,0.35g,Na2HPO4,0.048g,D-Glucose,1.00g,Phenol Red,0.01g,EDTA4Na 溶液,一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便,常用工作液浓度为0.02%。,注意：使用EDTA 处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长,EDTA 溶液配制：,用D-Hanks 平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，4冰箱保存,血清,热灭活：56,30 分钟加热已完全解冻的血清,热灭活目的：灭活血清中的补体成分。,如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活。,因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量。灭活后严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。,血清中的沉淀物,絮状物,：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm,5 分钟去除，也可不用处理,显微镜下“小黑点”,：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清,血清质量好坏是实验成败的关键。,常用血清：,胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，以胎牛血清质量最好。,优质血清的标准：,透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。,抗菌素的使用：,在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。,通常是青霉素和链霉素联合使用。,最终使用浓度为每毫升100单位。,庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定,pH 调整液,NaHCO3 溶液（碱）,常用浓度为7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，4保存,HEPES（分子量238.31）溶液,一种,弱酸,，羟乙基哌秦乙硫磺酸，对细胞无毒性,主要作用:防止培养基pH迅速变动。,在开放式培养条件下，观察细胞时培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES,使用终浓度一般为10-50,mmol/L,常配成1M 储存液：用20ml 双蒸水溶解4.76克HEPES，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，4保存。,使用时可向100ml培养液中加入2ml,HEPES,浓缩液，终浓度为20mmol/L,完全培养基的组成,基础培养基 80一95,血清 5一20,碳酸氢钠 2.0 g/L,青、链霉素 各100单位毫升,