分子荧光光度法

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,分 子 荧 光 光 度 法,第一节,概 述,一、光致发光,物质分子吸收特定波长的光能后，由基态跃迁至激发态。处于激发态的物质分子是不稳定的，可能通过辐射（发光）或非辐射的形式放出多余的能量，由激发态重新回到基态。,物质分子吸收外来光被激发后所产生的发光现象，叫光致发光。,荧光,10,-9,10,-6,s,实用,磷光,10,-3,10s,不实用,二、荧光光度法,利用测量荧光强度而建立起来的一类测定物质含量的分析方法，称为,荧光光度法,，即荧光法。,优点：灵敏度高，,10,-7,10,-9,g/ml,，,比紫外分光光度法灵敏度高,101000,倍。,第二节,基本原理,一、荧光的产生,基态,激发光,激发态,去激发,基态,（一）,激发,处于基态的物质分子吸收光能时，其电子对中的一个电子被激发到某一较高能级。,基态单重态 所有电子都自旋配对的分子电子态。,激发态 激发单重态,S,1,S,2,激发三重态,T,1,T,2,(,二,),去激发,指分子中处于激发态的电子以辐射或非辐射方式回到基态的过程。,辐射跃迁,荧光,去激发 磷光,振动驰豫,无辐射跃迁,内转移,（热的形式）,体系间跨越,外转移,1,、,振动驰豫,同一电子能级中，电子由高振动能级跃迁到低振动能级，并将能量以热的形式传递给溶剂分子，这一过程称振动驰豫。,2,、,内转移,两个相邻电子能级相距较近，以致其振能级重叠时，电子由高电子能级跃迁至低电子能级，同时将能量以热的形式传递给溶剂分子。,意义：,无论分子中的电子最初被激发至哪一激发单重态（如,S,1,、,S,2,、,S,3,),，,它都能通过内转移和振动驰豫到达,S,1,的最低振动能级上。,一般情况下，,S,1,与,S,0,之间很难发生内转移；,T,1,与,S,0,之间发生内转移的几率要大些。,3,、,体系间跨越,电子由激发单重态向激发三重态的无辐射跃迁称为体系间跨越。常见于含重原子,(I,、,Br),的有机分子中。,4,、,外转移,激发态分子与溶剂分子或其它溶质相互作用，以热的形式失去多余的能量回到基态，这一过程叫分子的外转移。外转移后，分子的荧光或磷光减弱或消失，称“,猝灭,”或“熄灭”。磷光寿命长，发生外转移机率大，所以室温下很难见到磷光。,5,、,荧光发射,电子由第一激发单重态,S,1,（,最低振动能级）跃迁至基态,S,0,而发射的光叫荧光。,6,、,磷光发射,电子由第一激发三重态,T,1,跃迁至基态,S,0,而发射的光叫磷光。,跃迁方式 时间,振动驰豫,10,-12,10,-14,S,内转移,10,-11,10,-13,S,荧光,10,-6,10,-9,S,磷光,10,-4,10 S,二、影响荧光的因素,荧光效率,：,f,=,发射荧光的分子数,被激发的分子总数,荧光效率越大，表示分子产生荧光的能力越强。,1,、分子结构,(1)*,跃迁能产生较强荧光。,产生荧光的主要跃迁类型,(2),含,-,共轭体系的有机分子，电子共轭程度越大，荧光效率越大。,(3),刚性结构和共平面效应：随分子的刚性和共平面性增加，电子共轭程度亦增加，荧光效率增大。,(4),取代基效应：斥电子基,f,吸电子基,f,重原子,f,2,、,环境因素,(1),温度 温度,荧光效率,(2),溶剂 极性,荧光,(3),溶液,pH,值 影响荧光物质存在形式。因此要严格控制溶液,pH,值。,(4),荧光熄灭剂（卤素离子、重金属离子等等）,3,、荧光物质浓度,自熄灭：当荧光物质高到一定浓度时，荧光分子间碰撞增多，使荧光强度减弱的现象。,原理图,荧光测量应在垂直激发光方向上进行。,一、光源,特点：光强度大，适用范围宽。,常用：高压汞灯，氙灯，溴钨灯，激光，脉冲激光,二、单色器 干涉滤光片，光栅,三、样品池 石英杯,四、检测器 光电倍增管,第三节 荧光光度计,日立,850,型荧光分光光度计,第四节,定量分析方法,原理：,一定条件下，荧光强度（,I,f,),与浓度,(c),呈线性关系。,I,f,=,Kc,定量分析的依据,方法：,标准曲线法和标准对比法,第五节,分析条件的选择,线性范围、激发光波长、荧光波长、散射光的排除,一、线性范围的选择,荧光物质浓度较低时，荧光强度与物质浓度呈线性关系。,二、选择激发波长和荧光波长,1,、,激发波长的选择,激发光谱,：将光源发射的激发光用单色器单色后照射物质，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定相应的荧光强度，所得荧光强度,-,激发波长图谱，称激发光谱。,一般选择最大激发波长作为激发光波长。,2,、,荧光波长的选择,荧光光谱,：用最大激发波长的激发光照射荧光物质时，依次测定所发射的各波长的荧光强度，所得荧光强度,-,荧光波长图谱，称为荧光光谱。,一般选择荧光强度最强的波长作为测定波长。,三、散射光干扰的排除,1,、,散射光,当用一束光照射溶液时，大部分光被吸收和透过，还有小部分被溶剂分子碰撞而向四面八方散射，这种光称散射光。,瑞利散射光 波长与激发光波长一样,拉曼散射光 波长比激发光波长长,2,、,消除方法,（,1,）选择适宜的激发光波长,用不同波长的激发光照射某一荧光物质，所产生的荧光峰位波长相同，但产生的拉曼散射光峰位各不相同。所以，可通过选择某一适宜的激发波长，使产生的拉曼散射光峰位远离荧光峰位而不干扰。,（,2,）选择合适的溶剂,拉曼散射光主要来源于溶剂。不同溶剂产生的拉曼散射光波长不同，所以，通过选择不同溶剂使散射光波长远离荧光波长，而消除其干扰作用。,第六节,应 用,因荧光光度法具有灵敏度高、选择性好、取样量少等优点，而被广泛应用于医学检验、药物分析、环境监测和卫生防疫等领域。,4,、,5,、,6,返回,1,、,2,返回,