细胞工程6原生质体培养和植物体细胞杂交

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,C,ELL,ENGINEERING,细胞工程,课程初步安排：36学时,第一章 绪,论,论4个学时第二,章,章 实验室,配,配置及基本技术2个学,时,时第三章,植,植物细胞工,程,程的理论基础4个学时,第,第四章 植,物,物组织器官培养,技,技术6,个,个学时第五章,植,植物细胞,培,培养及次生代谢,产,产物生产 3个,学,学时第六章,原,原生质体培,养,养和体细胞杂交3个学时第七,章,章 人工种,子,子1个学时,第,第八章,植,植物种质资源离,体,体超低温保存1个学,时,时第九章,动,动物组织培养3个学时,第,第十章动物,细,细胞融合与单克,隆,隆抗体4个学时,第,第十一,章,章动物组织与,胚,胚胎工程1个学时,第,第十二章试管,动,动物与克隆动物2,个,个学时,第六,章,章,原生,质,质体,培,培养和植物,体,体细,胞,胞杂,交,交,原生,质,质体,的,的概,念,念,植物,原,原生,质,质体,（,（protoplast）,是,是指,除,除去,了,了细,胞,胞壁,后,后的,裸,裸露,的,的球,形,形细,胞,胞。,原生,质,质体,能,能进,行,行植,物,物细,胞,胞的,各,各种,基,基本,生,生命,活,活动,，,，如,蛋,蛋白,质,质和,核,核酸,合,合成,、,、光,合,合作,用,用、,呼,呼吸,作,作用,以,以及,通,通过,质,质膜,的,的物,质,质交,换,换等,，,，这,极,极有,利,利于,探,探讨,许,许多,细,细胞,生,生理,问,问题,。,。同,时,时，,由,由于,原,原生,质,质体,在,在诱,导,导条,件,件下,能,能发,生,生融,合,合，,离,离体,培,培养,条,条件,下,下可,能,能再,生,生植,株,株。,因,因此,原,原生,质,质体,培,培养,研,研究,在,在理,论,论上,和,和实,践,践上,都,都具,有,有重,要,要意,义,义。,原,生,生,质,质,体,体,培,培,养,养,的,的,基,基,本,本,原,原,理,理,原,生,生,质,质,体,体,培,培,养,养,的,的,发,发,展,展,历,历,程,程,：,：,-,1880,年,年,，,，Hanstein,首,首,次,次,使,使,用,用,原,原,生,生,质,质,体,体protoplast,一,一,词,词,-,1960,年,年,，,，Cocking,首,首,次,次,采,采,用,用,纤,纤,维,维,素,素,酶,酶,从,从,番,番,茄,茄,幼,幼,苗,苗,的,的,根,根,尖,尖,中,中,分,分,离,离,原,原,生,生,质,质,体,体,获,获,得,得,成,成,功,功,-,1971,年,年,，,，Takebe,等,等,首,首,次,次,得,得,到,到,烟,烟,草,草,叶,叶,肉,肉,原,原,生,生,质,质,体,体,培,培,养,养,的,的,再,再,生,生,植,植,株,株,-,1985,年,年,，,，Fujimura,等,等,获,获,得,得,第,第,一,一,例,例,禾,禾,谷,谷,类,类,作,作,物,物,-,水,水,稻,稻,原,原,生,生,质,质,体,体,培,培,养,养,再,再,生,生,植,植,株,株,-,1986,年,年,，,，Spangenberg,等,等,利,利,用,用,单,单,个,个,原,原,生,生,质,质,体,体,培,培,养,养,再,再,生,生,植,植,株,株,，,，,在,在,甘,甘,蓝,蓝,型,型,油,油,菜,菜,上,上,获,获,得,得,成,成,功,功,据,统,统,计,计,，,，,自,自1971,年,年Takebe,首,首,次,次,报,报,道,道,从,从,烟,烟,草,草,叶,叶,肉,肉,原,原,生,生,质,质,体,体,再,再,生,生,植,植,株,株,后,后,，,，,已,已,有,有49,个,个,科,科160,多,多,个,个,属,属,的,的360,多,多,种,种,植,植,物,物,经,经,原,原,生,生,质,质,体,体,培,培,养,养,得,得,到,到,了,了,再,再,生,生,植,植,株,株,。,。,其,其,趋,趋,势,势,仍,仍,以,以,农,农,作,作,物,物,和,和,经,经,济,济,作,作,物,物,为,为,主,主,，,，,但,但,已,已,开,开,始,始,从,从,一,一,年,年,生,生,向,向,多,多,年,年,生,生,、,、,草,草,本,本,向,向,木,木,本,本,、,、,高,高,等,等,植,植,物,物,向,向,低,低,等,等,植,植,物,物,扩,扩,展,展,。,。,原,生,生,质,质,体,体,的,的,制,制,备,备,优,点,点,：,：,条,条,件,件,温,温,和,和,，,，,原,原,生,生,质,质,体,体,完,完,整,整,性,性,好,好,，,，,得,得,率,率,高,高,等,等,。,。,（,一,一,）,）,原,原,生,生,质,质,体,体,的,的,分,分,离,离-,酶,酶,解,解,法,法,影,响,响,因,因,素,素,：,：,供,供,试,试,材,材,料,料,，,，,酶,酶,的,的,种,种,类,类,、,、,浓,浓,度,度,以,以,及,及,其,其,组,组,合,合,，,，,酶液渗透,压,压，酶解,时,时间和温,度,度，纯化,方,方法,1、材料,的,的来源,实践证明,，,，幼嫩叶,片,片，萌发,种,种子的下,胚,胚轴、子,叶,叶以及愈,伤,伤组织和,悬,悬浮培养,物,物等均是,原,原生质体,的,的良好来,源,源：,-叶肉,细,细胞是分,离,离原生质,体,体的较好,材,材料，从,叶,叶片中可,分,分离出大,量,量的较均,匀,匀一致的,原,原生质体,。,。由叶片,制,制备原生,质,质体时，,植,植株的年,龄,龄和生长,条,条件十分,重,重要一般,选,选用植株,上,上充分展,开,开的叶片,；,；,-愈伤,组,组织和悬,浮,浮细胞系,，,，由于其,生,生长快速,稳,稳定，受,环,环境条件,的,的影响不,大,大容易获,得,得大量高,质,质量的原,生,生质体。,细,细胞系建,立,立时间的,长,长短，继,代,代培养的,时,时间和培,养,养基的成,分,分等都影,响,响原生质,体,体分离的,数,数量和质,量,量。一般,选,选用结构,疏,疏松并处,于,于对数生,长,长期的细,胞,胞分离原,生,生质体的,效,效果较好,。,。,外植体材,料,料用黑暗,处,处理、低,温,温处理和,不,不同光质,照,照射以及预培养等,方,方法，可,以,以提高某,些,些材料原,生,生质体的,产,产量和活,力,力。不同,植,植物及材,料,料类型预,处,处理方法,不,不同：,-龙胆,试,试管苗只,有,有用4,处,处理后分,离,离的原生,质,质体才能,分,分裂；,-甘蔗,植,植株只有,在,在黑暗条,件,件下培养12小时,后,后分离的,原,原生质体,才,才能分裂,；,；,-马铃,薯,薯试管苗,叶,叶片需在,黑,黑暗下处,理,理48小,时,时后分离,原,原生质体,，,，才会获,得,得较高的,原,原生质体,产,产量。,2、预处,理,理及酶解,酶,酶解,渗透压调,节,节剂,酶,来,来,源,源,生,生产厂,家,家,纤维素酶,类,类,onozukaR10,绿,绿色,木,木霉Yakult HonshaCo.Ltd., Tokyo, Japan,Cellulysin,绿,绿,色,色木霉Calbiochem.,SanDiego,CA 92037, USA,DriselaseIrpex lutensKayowa HakkoKogyo Co.,Tokyo, Japan,果胶酶类,Macerozyme R-10,根,根霉YakyltHonsha Co. Ltd.,Tokyo, Japan,Pectinase,根,根霉SigmaChemicalCo., St. Louit,MO63178,USA,Pectolyase Y-23,黑,黑曲霉Seishin Pharm.Co.Ltd., Tokyo, Japan,半纤维素,酶,酶,RhozymeHP-150,黑,黑曲霉Rohm and HassCo.,Philadelphia, PA 19105,USA,Hemicellulase,根,根霉SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO 63178,USA,原生质体,分,分离常用,的,的商品酶,甘露醇、,山,山梨醇、,蔗,蔗糖、葡,萄,萄糖等,-调节,酶,酶液渗透,压,压，使其,与,与所处理,细,细胞的渗,透,透压相似,，,，保证原,生,生质,体活力，,使,使用浓度,根,根据植物,材,材料而异,，,，一般在0.20.8mol/L,CaCl,2,2H,2,O，KH,2,PO,4,，MES,（,（ 2-,氮,氮吗啉乙,烷,烷磺酸）,，,，葡聚糖,硫,硫酸钾,-提高,原,原生质体,膜,膜的稳定,性,性,AgNO3、过氧,化,化物歧化,酶,酶(SOD),-减轻,酶,酶解时产,生,生的乙烯,、,、氧自由,基,基对细胞,膜,膜的损伤,牛血清蛋,白,白,-可防,止,止细胞壁,降,降解过程,中,中对细胞,膜,膜和细胞,器,器的破坏,酶解时间,酶浓度,酶解温度,利用尽可,能,能低的酶,浓,浓度和尽,可,可能短的,酶,酶解时间,获得,大,大量,而,而有,活,活力,的,的原,生,生质,体,体！,酶解,过,过程,一,一般,为,为将,酶,酶解,材,材料,放,放入,装,装有,酶,酶液,的,的培,养,养皿,中,中进,行,行酶,解,解，,或,或在,静,静止,条,条件,下,下每,隔,隔一,段,段时,间,间轻,轻,轻摇,动,动，,或,或将,培,培养,皿,皿放,在,在30,50r/min,的,的摇,床,床上,轻,轻轻,振,振荡,以,以游,离,离原,生,生质,体,体。,应,应注,意,意以,下,下条,件,件：,a、,植,植物,材,材料,应,应按,比,比例,和,和酶,液,液混,合,合，,才,才能,有,有效,地,地游,离,离原,生,生质,体,体,b、,不,不同,材,材料,其,其生,理,理特,性,性不,同,同，,对,对酶,液,液中,渗,渗透,压,压的,要,要求,也,也不,同,同,c、,酶,酶的,种,种类,、,、浓,度,度和,酶,酶解,时,时间,因,因材,料,料而,异,异,d、,酶,酶液pH,值,值一,般,般在5.4,6.0,e、,酶,酶解,温,温度,控,控制,在,在24,28,左,右,右,f、,黑,黑暗,或,或弱,光,光下,进,进行,（二,）,）,原,原生,质,质体,的,的纯,化,化,因植,物,物材,料,料和,所,所使,用,用的,渗,渗透,压,压稳,定,定剂,不,不同,，,，进,一,一步,纯,纯化,方,方法,有,有：,1、,沉降,法,法,2、,漂浮,法,法,3、,梯度,离,离心,法,法,沉降,法,法,方法,：,：将,收,收集,的,的滤液低速,离,离心,，,，使,原,原生,质,质体,沉,沉降,于,于管,底,底。,转,转速,的控,制,制以,将,将原,生,生质,体,体沉,淀,淀而,细,细胞,碎,碎片,等,等杂,质,质仍,悬,悬浮,在,在上,清,清液,中,中,为准,，,，一,般,般为500800r/m,下,下离,心,心3,5min。,用,用吸,管,管小,心,心地,吸,吸取,上清,液,液，,再,再用洗涤液洗原生质体3次，最后,用,用培养基洗涤1次，,调整到一定,密,密度后进行,培,培养。,-,纯化收集方,便,便，操作简,单,单，原生质,体,体丢失少。,-,在漂洗过程,中,中容易造成,原,原生质体的,损,损伤，并且,纯,纯度不够好,，,，,存在少量脱,壁,壁不完全的,细,细胞和破碎,的,的原生质体,。,。,漂浮法,方法：将收,集,集的滤液于1000r/m的转速,下,下离心10min，原,生,生质体,将漂浮于溶,液,液的表面，,细,细胞碎片等,杂,杂质将下沉,到,到管底。用,吸,吸管,吸出原生质,体,体并转入到,另,另一离心管,中,中，反复3,次,次，用培养,基,基洗涤,1次后调整,到,到所需密度,进,进行培养。,-,可以收集到,较,较为纯净的,原,原生质体，,并,并且可以避,免,免在离心纯,化,化过程中因,振,振荡撞击或,挤,挤压引起的,原,原生质体破,裂,裂或损伤。,-,原生质体在,数,数量上损失,较,较多。,界面法,梯度离心法,方法：采用,两,两种比重不,同,同的溶液，,离,离心后使完,整,整无损的原,生,生质,体处在两液,相,相的界面之,间,间,而细胞,碎,碎片等杂质,沉,沉于管底。,用,用此法,可获得更为,纯,纯净的原生,质,质体。,以柑桔为例,：,：,25%蔗糖,溶,溶液,13%甘露,醇,醇溶液,（三） 原,生,生质体活力,的,的测定,1. 荧光,素,素双醋酸酯(FAD),染,染色法,2. 酚藏,花,花红染色法,3. 荧光,增,增白剂染色,法,法,4. 伊凡,蓝,蓝染色法,二乙酸荧光,素,素(fluorescein diacetate,FDA)染色,法,法,FDA本身,无,无荧光，无,极,极性，能透,过,过细胞质膜,，,，一旦进入,原,原生,质体后能在,内,内酯酶作用,下,下分解形成,有,有荧光的极,性,性物质荧,光,光素,荧光素不能,自,自由穿越细,胞,胞质膜而积,累,累在原生质,体,体当中，在,荧,荧光,显微镜下观,察,察时，凡发,淡,淡绿色荧光,的,的是有活力,的,的原生质体,，,，无,荧光或荧光,很,很微弱的已,经,经死亡或活,力,力低的原生,质,质体。,原生质体的,培,培养,原生质体培养基,原生质体培养方法,愈伤组织形成和植株再生,影响原生质体培养的因素,1.无机盐,大,大量元素,浓,浓度；NO,3,-,与NH,4,+,的比例；Ca,2,+,浓度,2.有机成,分,分 维生素,、,、氨基酸、,糖,糖及糖醇、,酵,酵母提取物,、,、,水解酪蛋白,3.激素：,生,生长素先高,到,到低,4.渗透压,：,：培养基渗,透,透压和细胞,渗,渗透压等渗,原生质体培养基,液体浅层培,养,养,过程：将原生质,体,体以一定密,度,度悬浮在培,养,养液中，用,吸,吸管将原生,质,质体悬浮液,转,转移到培养,皿,皿或三角瓶,中,中使成一薄,层,层。膜密封,后,后置于人工,培,培养箱中，,静,静置培养。,优点：操作简便,，,，对原生质,体,体伤害小，,通,通气性好，,代,代谢物易扩,散,散易于补充,新,新鲜培养基,，,，形成细胞,团,团或小愈伤,组,组织后易于,转,转移，较广,泛,泛采用。,缺点：原生质体,在,在培养基中,分,分布不均匀,，,，常发生原,生,生质体间的,黏,黏连现象或,造,造成局部密,度,度过高，从,而,而影响原生,质,质体再生细,胞,胞的进一步,发,发育，并且,难,难以定点观,察,察和跟踪单,个,个原生质体,的,的生长发育,过,过程。,固体培养,琼脂（糖,）,）平板培养,或,或包埋培养,过程：将原生质,体,体悬浮液与35的琼,脂,脂（糖）培,养,养基等量混,合,合，,使琼脂（糖,）,）最终浓度,为,为0.6%,左,左右，迅速,并,并轻轻摇动,使,使原生质体,均匀分布，,然,然后转移至,培,培养皿，冷,却,却后原生质,体,体包埋在琼,（,（糖）,培养基中，,封,封口后培养,。,。,优点：原生质体,被,被彼此分开,并,并固定位置,，,，便于定点,观,观察，跟踪,单,单,个原生质体,发,发育过程，,易,易于统计原,生,生质体的分,裂,裂频率和植,板,板率；,同时避免了,细,细胞间有害,代,代谢产物的,影,影响。,缺点：对操作要,求,求较严，在,原,原生质体悬,浮,浮液与琼脂,（,（糖）培养,基,基,混合时温度,必,必须合适，,太,太高会影响,原,原生质体活,力,力，太低培,养,养基的,凝固较快使,得,得原生质体,分,分布不均匀,；,；并且原生,质,质体的生长,发,发育比,液体浅层法,慢,慢。已较少,采,采用。,液体浅层-,固,固体平板双,层,层培养法,过程：在培养皿,的,的底部铺一,薄,薄层含琼脂,（,（糖）的固,体,体培养基，,再将原生质,体,体悬浮液加,于,于固体培养,基,基表面进行,液,液体浅层培,养,养。,优点：固体培养,基,基中的营养,成,成分可以缓,慢,慢地释放到,液,液体培养基,中，补充培,养,养物对营养,的,的消耗。同,时,时，如在下,层,层培养基中,添,添加,一定量的活,性,性炭，可有,效,效地吸附培,养,养物产生的,有,有害物质，,促,促进,原生质体的,分,分裂及细胞,团,团的形成。,缺点：不易观察,细,细胞的发育,过,过程。,琼脂糖珠培,养,养,过程：,将含有原生,质,质体的液态,琼,琼脂糖培养,基,基用吸管以,大,大约50ul一滴的量,滴,滴于直径6cm的培养,皿,皿，待其固,化,化后，向其,中,中添加3ml液体培养,基,基并于摇床,上,上低速旋转,培,培养。,优点：可通过调,整,整液体培养,基,基的渗透压,来,来调节培养,物,物的渗透压,以,以利于原生,质,质体进一步,生,生长和发育,。,。由于改变,了,了培养物的,通,通气和营养,环,环境，从而,可,可促进原生,质,质体的分裂,及,及细胞团的,形,形成。,饲养层培养-看护培养,、,、滋养培养,过程：该法又可,分,分为分层培,养,养和混合培,养,养。,分层培养是,先,先制备固体,的,的饲养细胞,层,层，再在其,上,上植板培养,层,层。,用x射线照,射,射部分分离,的,的原生质体,，,，照射后将,原,原生质体洗23次，,包埋于琼脂,培,培养基中，,然,然后铺于培,养,养皿的底层,构,构成饲养细,胞,胞层。,将欲培养的,有,有活力的原,生,生质体植板,于,于饲养细胞,层,层上面进行,培,培养。,混合培养是,将,将经过x射,线,线照射而失,去,去分裂能力,的,的原生质体,与,与,有活力的原,生,生质体相混,合,合，并包埋,于,于琼脂培养,基,基中进行固,体,体平板,法培养。,优点：适合于原,生,生质体低密,度,度培养和某,些,些难以培养,的,的植物原生,质,质,体的培养。,培养条件,主要指培养,的,的光照和温,度,度。原生质,体,体培养对培,养,养条件的要,求,求十分严格,，,，且不同来,源,源的原生质,体,体在不同的,培,培养阶段有,不,不同要求。,一,一般来说：,-新分离,原,原生质体应,在,在散射光或,黑,黑暗中培养,，,，诱导分化,阶,阶段再置于,光,光下培养，,光,光强10003000lx，光,周,周期每天1016h,-不同的,植,植物原生质,体,体培养对温,度,度的要求不,尽,尽相同，一,般,般为2530,细胞壁再生,细胞分裂,愈伤组织,形成,植株再生,愈伤组织形成和植株再生,-,原生质体培,养,养数小时后,开,开始再生新,的,的细胞壁，,一,一至数天内,便,便可形成完,整,整的细胞壁,。,。,-电镜观,察,察发现，原,生,生质体培养,数,数小时后新,壁,壁开始形成,，,，先是由质,膜,膜合成形成,细,细胞壁的主,要,要成分微纤,维,维，然后转,移,移到质膜表,面,面进行聚合,作,作用产生多,片,片层的结构,，,，以后在质,膜,膜与片层结,构,构之间或在,膜,膜上产生小,纤,纤维丝，逐,渐,渐形成不定,向,向的纤维团,，,，最后形成,完,完整的细胞,壁,壁。,(1) 细,胞,胞壁再生,-原生质,体,体一般培养27d后,开,开始第一次,分,分裂，此时,间,间随植物的,种,种类、分离,原,原生质体的,材,材料、原生,质,质体的质量,、,、培养基的,成,成分和培养,条,条件而异。,-用幼苗,的,的下胚轴和,子,子叶、幼根,、,、悬浮培养,的,的细胞和未,成,成熟种子的,子,子叶等为材,料,料分离的原,生,生质体，一,般,般比用叶肉,分,分离的原生,质,质体容易诱,导,导分裂，第,一,一次分裂出,现,现的时间较,快,快。,(2) 细,胞,胞分裂和生,长,长,-,大多数情况,下,下，原生质,体,体培养二周,后,后形成多细,胞,胞细胞团，,三,三周后形成,肉,肉眼可见的,小,小细胞克隆,，,，大约六周,后,后形成直径1mm的小,愈,愈伤组织。,-原生质,体,体培养710天后必,需,需及时添加,新,新鲜培养基,，,，否则形成,的,的细胞团不,继,继续生长，,待,待小愈伤组,织,织长至1mm左右时应,及,及时转移到,固,固体培养基,上,上使其进一,步,步生长。,(3) 愈,伤,伤组织的形,成,成,-,原生质体形,成,成的愈伤组,织,织直接转移,到,到分化培养,基,基上可进一,步,步成苗。越,来,来越多实验,证,证明，两步,成,成苗法更适,合,合大多数植,物,物原生质体,再,再生植株。,即,即，首先将,愈,愈伤组织培,养,养于低浓度,生,生长素培养,基,基上，让其,增,增殖和调整,状,状态再转移,到,到分化培养,基,基上分化成,苗,苗。,(4) 植株再,生,生,基因型,原生质体的来源,起始培养密度和,培,培养基,影响原生质体培养的因素,植物原生质体培,养,养程序示意图,原生质体分离,机械法分离原生,质,质体,酶法分离,影响原生质体活,力,力的因素,原生质体纯化,沉降法,漂浮法,界面法,原生质体培养,平板培养、浅层,液,液体培养、双层,培,培养法,细胞密度10,4, 10,5,个/mL（因种,类,类而异）,培养成功的关键,细胞壁再生,植物种类和材料,的,的生理状态,培养细胞所处时,期,期（旺盛分裂期,则,则快）,与质膜稳定剂和,渗,渗透压稳定剂有,关,关,细胞分裂形,成细胞团,基本培养基筛选,激素种类和浓度,调,调节,渗透压调节,器 官 形,成,成,植 株 再,生,生,基本培养基无机,盐,盐浓度筛选,激素种类和浓度,调,调节,渗透压调节,原生质体培养的,意,意义：,1、原生质体融,合,合,原生质体培养成,功,功为开展体细胞,杂,杂交奠定了基础,，,，通过不同材料,的,的原生质体融合,克,克服传统育种方,法,法所面临的生殖,障,障碍，创造新的,种,种质材料。,2、筛选突变体,原生质体在培养,过,过程中能够产生,体,体细胞无性系变,异,异，且对外界理,化,化因子更为敏感,易,易诱发突变，可,从,从中选出具有优,良,良性状的变异体,，,，成为农作物改,良,良的重要遗传资,源,源。,3、遗传转化,原生质体容易摄,取,取外源遗传物质,，,，如细胞器、细,胞,胞核、细菌、病,毒,毒、质粒和各种DNA分子，使,其,其能够作为遗传,转,转化的受体系统,。,。目前，PEG,法,法、电激法、脂,质,质体法、基因枪,法,法等均已用于原,生,生质体转化研究,，,，获得了大豆等,一,一系列转基因植,株,株,4、基础研究,原生质体为细胞,生,生物学、发育生,物,物学、细胞生理,学,学、病毒学等学,科,科的基础理论研,究,究提供了理想的,实,实验体系，可用,于,于研究细胞壁再,生,生、细胞膜的结,构,构及离子转运、,细,细胞器的光合作,用,用、呼吸作用等,。,。,体细胞杂交(somatichybridization),是,是指两个离体细,胞,胞通过一定的诱,导,导技术使质膜接,触,触而融合在一起,，,，随后导致两个,细,细胞核物质融合,的,的技术。植物体,细,细胞杂交则是指,除,除去细胞壁的原,生,生质体融合(protoplast fusion) 。,一、体细胞杂交,的,的概念,融合过程不存在,有,有性杂交过程中,的,的种性隔离机制,的,的限制，为远缘,物,物种间的遗传物,质,质交换提供了有,效,效途径。,体细胞杂交产生,的,的杂种细胞有来,自,自双亲的核外遗,传,传系统。在杂种,的,的分裂和增殖过,程,程中双亲的叶绿,体,体、线粒体DNA，亦可发生重,组,组，从而产生新,的,的核外遗传系统,。,。,理论上说，任何,细,细胞都有可能通,过,过体细胞杂交而,成,成为新的生物资,源,源。这对于种质,资,资源的开发和利,用,用具有深远意义,。,。,对称融合（asymmetric fusion）即两个完,整,整的细胞原生质,体,体融合。,非对称融合（symmetric fusion）利用物理,或,或化学的方法使,某,某亲本的核或细,胞,胞质失活后再进,行,行融合，它可以,分,分为几种：,根据融合时细胞,的,的完整程度，原,生,生质体融合可分,为,为两大类：,目前开展的融合,试,试验中绝大部分,是对称融合，此,融,融合方式在获得,农艺性状互补的,体,体细胞杂种方面,具有一定的优势,，,，但由于它综合,了双亲的全部性,状,状，在导入有利,性状同时也不可,避,避免带入了一些,不利性状。尤其,在,在一些远缘组合,中，由于存在,一,一定程度的体,细,细胞,不亲和性，使,得,得杂种植株的,表,表现,并非预期理想,。,。,对称融合,首例非对称杂,种,种是由 x,射,射线辐射处理,后,后的欧芹原生,质,质体与烟草原,生,生质体相融合,得,得到的。这一,融,融合方法由于,在,在转移部分遗,传,传物质方面具,有,有独特优点而,受,受到重视。,非对称融合,物理方法常采,用,用射线处理，,如,如X射线、射,线,线等，它们能,使,使细胞核失活,；,；,化学处理目前,常,常用的试剂有:,核失活碘乙,酰,酰胺（IOA,）,）、碘乙酸(Iodoacetate),；,；,质失活罗丹,明,明（R6G，一种亲脂,染,染料，能够抑,制,制线粒体的,氧化磷酸化过,程,程而达到失活,的,的目的）,用于细胞核或,细,细胞质失活的,方,方法分为物理,和,和化学两类：,二、原生质体,的,的融合,（一）原生质,体,体融合方法,PEG融合,电融合,PEG诱导融,合,合：,1 制备原,生,生质体悬浮液,；,；,2 混合好,的,的原生质体悬,浮,浮液中逐滴加,入,入,PEG溶液，,可,可在倒置显微,镜,镜下观察；,3 将PEG中的原生质,体,体于室温下保,温,温,1520min；,4 待大多数,细,细胞圆球化，,再,再在原生质体,悬浮液滴顶部,加,加一滴高钙溶,液,液，静置,1020min；,5 用原生质,体,体培养液洗涤,，,，500r/m离心,去除融合液，,培,培养原生质体,。,。,由于PEG分,子,子具有轻微的,负,负极性，故可,以,以与具有正极,性,性基团的水、,蛋,蛋白质和碳水,化,化合物等形成,氢,氢键,当PEG分子,链,链足够长时，,在,在相邻原生质,体,体之间形成分,子,子桥，其结果,是,是使原生质体,发,发生粘连,与膜相连的PEG分子被洗,掉,掉后，膜上电,荷,荷发生紊乱而,重,重新分配,另外，PEG,能,能增加类脂膜,的,的流动性，使,原,原生质体的核,、,、细胞器发生,融,融合成为可能,PEG融合的,机,机理：,-,+,-,+,-,桥梁,+,+,-,-,PEG被洗掉,+,+,-,-,电荷重排,+,+,-,-,原生质体膜接,触,触,+,+,-,融合,融合成本低，,勿,勿需特殊设备,融合子产生的,异,异核率较高,融合过程不受,物,物种限制,融合过程繁琐,PEG可能对,细,细胞有毒害,PEG融合的,特,特点：,电融合诱导法,：,：,1、将已制备,好,好的亲本原生,质,质体,均匀混合放入,融,融合小室中；,2、微电极型,的,的两个电极的,端,端部,同时与两靠近,的,的原生质体膜,表,表面,接触，所产生,的,的512mA的脉冲,电流间断刺激15ms，,原,原生质体,瞬时发生暂时,性,性的收缩，两,层,层膜,之间形成小孔,，,，连接成桥，,形,形成,一个个泡囊，,最,最后形成融合,体,体；,3、平行多电,极,极通过1MHz的交流,电场发生双向,电,电脉冲，原生,质,质体,在电场力作用,下,下极化产生偶,极,极子,原生质体紧密,排,排开成串珠状,，,，在,直流电脉冲作,用,用下，质膜被,击,击穿，,进一步形成融,合,合体。,1 细胞膜的,接,接触：当原生,质,质体置于电导,率,率很低的溶液,中,中时，电场,通电后，电流,即,即通过原生质,体,体而不是通过,溶,溶液，结果是,原,原生质体,在电场作用下,极,极化而产生偶,极,极子，从而使,原,原生质体紧密,接,接触排列,成串；,2 膜的击穿,：,：原生质体成,串,串排列后，立,即,即给予高频直,流,流脉冲后就,可以使原生质,膜,膜击穿，从而,导,导致两个紧密,接,接触的细胞融,合,合在一起,电融合的基本,过,过程：,电融合法的原,理,理,交流电场使原,生,生质体表面电,荷,荷偶极化，沿,着,着电极排列，,形成串珠,负极,正极,-,-,+,-,+,+,+,+,-,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,施加直流电场,后,后，形成串珠,的,的原生质体在,质,质膜接触处发,生,生,穿孔，开始遗,传,传物质的交流,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,-,交流电压,-交变电场,的,的振幅频率,-交变电场,的,的处理时间,-直流高频,电,电压,-脉冲宽度,-脉冲次数,电融合中的主,要,要参数：,一是不存在对,细,细胞的毒害问,题,题,二是融合效率,高,高,三是融合技术,操,操作简便,与PEG融合,比,比较起来，电,融,融合有三大优,点,点：,交流电使原生,质,质体排成串珠,直,直流电使原,生,生质体质膜发,生,生不可逆击穿,电融合仪的结,构,构特点：,一是交变电场,部,部分,一是高频直流,电,电击部分,（二）原生质,体,体融合过程,1、凝聚作用,阶,阶段，其间两,个,个或两个以上,的,的原生质体的,质,质膜彼此靠近,；,；,2、在很小的,局,局部区域质膜,紧,紧密粘连，彼,此,此融合，在两,个,个原生质体之,间,间,细胞质呈现连,续,续状态，或是,出,出现桥；,3、由于细胞,质,质桥的扩展，,融,融合完成，形,成,成球形的异核,体,体或同核体。,原生质体质量,融合方法,融合参数,(三)影响原,生,生质体融合的,因,因素,杂种细胞的发,育,育动态,杂种,细,细胞,的,的选,择,择系,统,统与,体,体细,胞,胞杂,种,种植,株,株的,鉴,鉴定,体细,胞,胞杂,种,种的,特,特点,体细,胞,胞杂,种,种后,代,代的,遗,遗传,三、,杂,杂种,细,细胞,的,的发,育,育动,态,态及,体,体细,胞,胞杂,种,种鉴,定,定,（一,）,）杂,种,种细,胞,胞的,发,发育,动,动态,核融,合,合,核质,重,重组,细胞,器,器重,组,组,部分,核,核物,质,质或,细,细胞,器,器丢,失,失,融合,核,核分,裂,裂,（二,）,）杂,种,种细,胞,胞的,选,选择,系,系统,与,与体,细,细胞,杂,杂种,植,植株,的,的鉴,定,定,1、,杂,杂种,细,细胞,的,的选,择,择系,统,统,外观选择,互补,选,选择,荧光,标,标记,选,选择,大豆,根,根间,悬,悬浮,培,培养,细,细胞,的,的+,粉,粉,蓝,蓝烟,草,草叶,肉,肉细,胞,胞,原生,质,质体,原,原,生,生质,体,体,异核,体,体,具有,浓,浓厚,细,细胞,质,质的,非,非绿,色,色,绿色,、,、液,泡,泡化,（1,）,）利,用,用天,然,然颜,色,色标,记,记分,离,离杂,种,种细,胞,胞：,既具,有,有粉,蓝,蓝烟,草,草原,生,生质,体,体特,有,有的,绿,绿色,质,质体,又具,有,有与,大,大豆,原,原生,质,质体,相,相似,的,的形,态,态和,丰,丰富,的,的细,胞,胞质,带,带,Galbraith等,用,用发,绿,绿色,荧,荧光,的,的异硫,氰,氰酸,荧,荧光,素,素（FITC,）,）和发,红,红色,荧,荧光,的,的碱性,蕊,蕊香,红,红荧,光,光素分别,标,标记,了,了两,种,种烟,草,草的,叶,叶肉,原,原生,质,质体,，,，有,效,效选,择,择出,了,了杂,种,种细,胞,胞。,（2,）,）利,用,用荧,光,光素,标,标记,分,分离,杂,杂种,细,细胞,对于,在,在形,态,态上,无,无法,区,区分,亲,亲本,和,和异,核,核体,的,的情,况,况下,，,，可,利,利用,非,非毒,荧,荧光,素,素标,记,记，,对,对两,种,种原,生,生质,体,体群,体,体分,别,别用,不,不同,荧,荧光,染,染料,标,标记,，,，诱,导,导融,合,合后,，,，或,是,是在,荧,荧光,显,显微,镜,镜下,镜,镜检,鉴,鉴别,异,异核,体,体，,或,或采,用,用荧,光,光激,活,活细,胞,胞分,选,选仪,（,（fluorescenceactivatedcellsorter,FACS,）,）分,选,选出,异,异核,体,体。,激素,自,自养,型,型互,补,补,营养,缺,缺陷,型,型互,补,补,抗性差异,性,性互补,白化突变,与,与野生型,互,互补,雄性不育,与,与雄性可,育,育型互补,隐性非等,位,位基因互,补,补,（3）利,用,用突变细,胞,胞系互补,进,进行选择-互补,选,选择法,粉蓝烟草,与,与朗氏烟,草,草细胞原,生,生质体均,需,需外源激,素,素才能生,长,长，融合,后,后形成的,双,双二倍体,杂,杂种细胞,可,可以产生,内,内源激素,，,，在培养,基,基上不需,加,加激素。,激素自养,型,型互补筛,选,选法,烟草硝酸还原酶缺失突变体,（cnx-）,烟草硝酸还原酶缺失突变体,（nia-）,融合,在硝酸盐培养基,上不能生长,在硝酸盐培养基,上能生长,在硝酸盐培养基,上不能生长,营养缺陷型互补选择法示意图,注： nia-型突变体由缺乏NR脱辅基酶蛋白造成；,cnx-型突变体由缺乏钼辅因子造成,营养缺陷,型,型互补筛,选,选法：,基于亲本,原,原生质体,对,对MS培,养,养基和放,线,线菌素D,的,的抗性差,异,异来进行,杂,杂种细胞,的,的筛选,亲本1：,对,对放线菌,素,素D抗性,，,，但在MS培养基,上,上不能超,过,过50个,世,世代,亲本2：,对,对放线菌,素,素D很敏,感,感，但能,在,在MS上,生,生长,融合后：,仅,仅杂种细,胞,胞能在含,有,有放线菌,素,素的MS,培,培养基上,生,生长,抗性互补,筛,筛选法：,利,利用亲本,细,细胞原生,质,质体对抗,生,生素、,除草剂及,其,其它有毒,物,物质的抗,性,性差异选,择,择杂种细,胞,胞。,体细胞杂,种,种的鉴定,-,形态学鉴,定,定,-细胞,学,学鉴定,-生化,分,分析,-分子,生,生物学方,法,法,体细胞杂,种,种的特点,-,变异幅度,大,大,-非整,倍,倍性,-双亲,性状的共,显,显性,-偏,亲现象,-染色,体,体重排,-体细,胞,胞有丝分,裂,裂异常,-染色,体,体部分丢,失,失与基因,转,转移,-体细,胞,胞杂种在,遗,遗传上的,不,不稳定性,体细胞杂,种,种后代的,遗,遗传,第四节,植,植物体细,胞,胞杂交技,术,术的应用,1、体细,胞,胞杂交合,成,成新物种-体细,胞,胞杂交可,以,以避开生,殖,殖细胞的,受,受精过程,，,，避免了,远,远缘物种,间,间杂交表,现,现出的受,精,精不亲和,或,或胚胎早,期,期败育现,象,象，实现,远,远缘物种,间,间的基因,转,转移，创,造,造新物种,。,。,Melchers,等,等(1978)用,番,番茄与马,铃,铃薯的一,个,个叶绿素,缺,缺失突变,体,体进行原,生,生质体融,合,合，获得,了,了一个属,间,间杂种，,被,被称为Pomato或Topato,。,。,2、通过,体,体细胞杂,交,交培育作,物,物新种质,和,和新品种-通过,近,近缘种内,或,或种间的,原,原生质体,融,融合，可,以,以获得稳,定,定的具有,双,双亲两套,染,染色体的,体,体细胞杂,种,种植株，,从,从而将近,缘,缘栽培种,或,或野生种,的,的一些有,益,益性状转,移,移到现有,栽,栽培种中,，,，从其后,代,代选育出,优,优良新品,种,种（系）,。,。,为了利用,马,马铃薯家,族,族中野生,种,种所具有,的,的优良抗,逆,逆性基因,，,，将特定,栽,栽培种和,野,野生种的,原,原生质体,融,融合，先,后,后获得抗PVY的,杂,杂种植株,及,及抗PLRV、PVY、晚,疫,疫病的体,细,细胞杂种,植,植株。,3、体细,胞,胞杂交创,造,造细胞质,杂,杂种-,与,与常规的,有,有性杂交,过,过程不同,体细胞,杂,杂交不仅,包,包括核基,因,因组，也,涉,涉及到双,亲,亲细胞质,。,。它不仅,可,可把细胞,质,质基因转,移,移到全新,的,的核背景,中,中，也可,使,使叶绿体,基,基因组与,线,线粒体基,因,因组重新,组,组合。农,作,作物的许,多,多性状如,雄,雄性不育,性,性状(CMS)由,细,细胞质控,制,制，这些,研,研究创造,了,了细胞质,变,变异的源,泉,泉。,体细胞,杂,杂交研,究,究的发,展,展趋势,-,融合亲,本,本遗传,背,背景的,了,了解,-,高效原,生,生质体,的,的制备,与,与培养,-,提高诱,导,导融合,频,频率及,其,其稳定,性,性,-,杂种细,胞,胞的培,养,养和发,育,育,-,杂种鉴,定,定技术,-,杂种后,代,代的遗,传,传规律,和,和性状,控,控制,体细胞,杂,杂交面,临,临的困,难,难,-许,多,多,原生质,体,体再生,程,程序效,率,率低，,重,重复性,差,差，有,基,基因型,依,依赖性,-,体细胞,杂,杂种植,株,株仍限,于,于少数,物,物种,-,转移期,望,望基因,和,和性状,的,的概率,较,较小,-,种间杂,种,种植株,大,大多不,育,育,