《生物化学教程》第三章酶化学解析课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 酶化学,本章内容,第一节 酶引论,第二节 酶动力学,第三节 酶作用机制和酶活性调节,第一节 酶引论,Ferment,（,酵素）,Enzyme,在酵母中（希腊文）,Enzyme (in yeast),enzyme,是希,腊,文,en = in,，,zyme = yeast,一、酶研究的简史（了解）,对酶的认识起源于生产与生活实践。,夏禹时代，人们掌握了,酿酒,技术。,公元前,12,世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。,春秋战国时期已知用,麴,(,曲,),治疗消化不良的疾病。,酶者，酒母也,（一） 酶的早期利用,（二）,19,世纪中叶对发酵本质的探讨,1857,巴斯德提出酒精发酵是,酵母细胞活动的结果,。,1,分子,Glc2,分子乙醇,+2,分子,CO,2,从,Glc,开始，经过,12,种酶催化，,12,步反应，生成乙醇。,1897Buchner,兄弟证明发酵与细胞的活动无关，,不含细胞的酵母汁也能进行乙醇发酵,。,1913,年,Michaelis,和,Menten,提出,米氏学说,酶促动力学原理。,（三）关于酶的化学本质的认识,1926,年,Sumner,首次从刀豆中提出脲酶结晶，并,证明具有蛋白质性质,。,1930,年,Northrop,等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步证明了,酶是蛋白质,。,J.B.Sumner,J.H.Northrop,（三）关于酶的化学本质的认识,某些,RNA,有催化活性,（,ribozyme,，核酶）,1982,年美国,T. Cech,等人发现四膜虫的,rRNA,前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现,RNA,有催化活性 。,Thomas Cech University of Colorado at Boulder, USA,1983,年美国,S.Altman,等研究,RNaseP,（由,20%,蛋白质和,80%,的,RNA,组成），发现,RNaseP,中的,RNA,可催化,E. coli tRNA,的前体加工。,Sidney Altman,Yale University New,Haven, CT, USA,Cech,和,Altman,各自独立地发现了,RNA,的催化活性，并命名这一类酶为,ribozyme,（核酶），,2,人共同获,1989,年诺贝尔化学奖。,（三）关于酶的反应机制的研究,酶是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专一性的特殊,蛋白质或核,酸。简单说，酶是一类由活性细胞产生的,生物催化剂,。,（四）酶的概念,二、酶是生物催化剂,（一）与一般催化剂的相同点,1.,提高反应速度，不改变平衡点,;,2.,只起催化作用，本身不消耗；,3.,降低反应的,活化能,。,（二）酶是催化剂，降低反应的活化能,概念：指在一定温度下，,1mol,底物全部进入活化态所需要的自由能。,-,单位：,KJ/mol,酶催化反应的实质：,降低反应的活化能,（三）酶作为生物催化剂的特点,酶的催化效率高（高效性）,酶的高度专一性（专一性）,酶活力受调节和控制（可调性）,酶催化反应条件温和，中性,pH,催化效率高,酶的催化效率比化学催化剂高,10,7 -,10,13,倍，比非催化反应高,10,5 -,10,17,倍。,(1),过氧化氢分解,2,H,2,O,2,2H,2,O + O,2,用,Fe3,+,催化，效率为6,10,-4,mol/mol,S，,而用过氧化氢酶催化，效率为6,10,6,mol/mol,S。,(2),-,淀粉酶催化淀粉水解,，,1,克结晶酶在,65,C,条件下可催化2吨淀粉水解。,酶的专一性,酶活力受调节,指通过,激活,或,抑制,以改变细胞内已有酶分子的,催化能力。,酶活力,的调节,酶,活性,（活力）的调节,酶,量,的调节（基因表达的调控）,别构,调节,共价,调节,反馈,抑制（顺序）,反馈,抑制（协同）,三、酶的化学本质,（一）酶的化学组成,酶,单纯酶（简单蛋白质）,缀合酶,（全酶）,=,酶蛋白,+,辅因子,单纯酶,单纯酶（,simple enzyme,）仅由氨基酸组成。例如：胃蛋白酶，淀粉酶，核糖核酸酶，脲酶。,缀合酶,有的酶属于缀合蛋白质，除了蛋白质组分外还有,非蛋白,组成，即缀合酶。,羧肽酶,NADPH,脱氢酶的辅酶,过氧化氢酶,（二）酶的辅助因子,酶的对热稳定的非蛋白小分子物质部分，其主要作用是,作为电子、原子或某些基团的载体参与反应并促进整个催化过程,。,辅助,因子,辅酶,与酶蛋白结合得比较松的小分子有机物。,辅基,与膜蛋白结合得紧密的小分子有机物。,金属激活剂,金属离子作为辅助因子。,酶的催化专一性主要,决定于酶蛋白部分,，辅因子通常是,作为电子、原子或某些化学基团的载体,。,重要的例子：,(1),传递电子体：,如 卟啉铁、铁硫簇；,(2),传递氢（递氢体）：,如,FMN/FAD,、,NAD/NADP,、,CoQ,、硫辛酸；,(3),传递酰基体：,如,CoA,、,TPP,、硫辛酸；,(4),传递一碳基团：,如 四氢叶酸；,(5),传递磷酸基：,如,ATP,，,GTP,；,(6),其它作用：,转氨基，如,VB,6,；传递,CO,2,，如 生物素。,小结：,1,、全酶由,和,组成，在催化反应时，二者所起的作用不同，其中,决定酶的专一性和高效率，,起传递电子、原子或化学基团的作用。,思考题,:,2,、具有生物活性的全酶，无辅助因子时,A.,有活性,B.,无活性,C.,无特异性,D.,不易失活,3,、,T,R,Cech,和,S.Alman,因各自发现了,而共同获得,1989,年的诺贝尔奖（化学奖）。,（三）酶的四级缔合（了解）,根据酶蛋白分子的特点：,单体酶：一般由一条肽链组成,寡聚酶：为寡聚蛋白，,2,个亚基,多酶复合体,：几种酶靠,非共价键,彼此嵌合而成。,-,由数个独立的酶组合起来形成络合体，催化一系列反应。（如糖代谢、脂代谢）,溶菌酶（单体酶）,丙酮酸脱氢酶复合体,1,：酰基转移酶（,AT,）,2,：丙二酰转移酶,(MT),3,：,酮脂酰,-ACP,合成酶,(KS),4,：,酮脂酰,-ACP,还原酶,(KR),5,：,羟,脂酰,-ACP,脱水酶,(HD),6,：,烯脂酰,-ACP,还原酶,(ER),7,：酰基载体蛋白（,ACP,）,大肠杆菌中的,FA,合成酶,四、酶的命名和分类,（一）酶的命名,2,、国际系统命名法,(systematic name),1,、习惯命名法,(recommended name),1,、习惯命名法,(recommended name),根据其,催化底物,来命名,(,蛋白酶；淀粉酶）；,根据所,催化反应的性质,来命名（水解酶；裂解酶）,结合上述两个原则来命名（琥珀酸脱氢酶）,有时在这些命名基础上加上,酶的来源,或其它特点（胃蛋白酶、胰蛋白酶,),2,、国际系统命名法,(systematic name),国际系统命名法原则，是以酶所催化的整体反应为基础，规定,每一种酶的名称应当明确标明酶的底物及催化反应的性质,。如果一种酶催化两个底物起反应，则两个底物都应写出，中间用,“：”,号隔开。,（国际酶学委员会年提出）, Thoms E.Barm,编,例如：,习惯名称,:,谷丙转氨酶,(GPT, ALT),系统名称,:,L-,丙氨酸：,-,酮戊二酸,氨基转移酶,酶催化的反应,:,-,酮戊二酸,+,丙氨酸,谷氨酸,+,丙酮酸,（二）酶的分类和编号（掌握）,1.,国际系统分类法分类原则,六大类酶的记忆诀窍：,氧转水，裂亦连,氧化还原酶,转移酶,水解酶,裂解酶,异构酶,连接酶,2.,六大酶类的特征,（,1,）氧化还原酶,Oxidoreductase,氧化还原酶催化,氧化,-,还原反应,。,主要包括,脱氢酶,和,氧化酶,，辅酶为,NAD,或,NADP,FAD,或,FMN.,反应通式：,AH,2,+BA+BH,2,C,H,O,CHOH,CH,2,O,P,+,NAD,+,+,Pi,CO,CHOH,CH,2,O,P,P,O,+,NAD,H,+H,+,甘油醛,3,磷酸脱氢酶,甘油醛,3,磷酸,甘油醛,1,，,3,二磷酸,（,2,）转移酶,Transferase,转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。,反应通式：,AR+B=A+BR,酮戊二酸,L,谷氨酸,酮酸,（,3,）水解酶,hydrolase,水解酶催化底物的加水分解反应。,主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。,AB+H,2,O=AOH+BH,（,4,） 裂解酶,Lyase,催化非水解地除去底物分子中的基团及其逆反应的酶。,反应通式：,AB=A+B,（,5,）异构酶,Isomerase,催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。,反应通式：,A,B,O,CH,2,OH,HO,OH,OH,OH,P,磷酸己糖异构酶,O,CH,2,OH,OCH,2,P,OH,OH,果糖,6,磷酸,葡萄糖,6,磷酸,（,6,）连接酶,Ligase or Synthetase,催化两个分子合成一个分子的反应，通常与,ATP,的裂解反应相耦联。,反应通式：,A,B+ATP,AB+ADP+Pi,在,每一大类酶,中又可根据不同的原则，分为,几个亚类,。每一个亚类再分为,几个亚亚类,。最后，再把属于每一个亚亚类的各种酶按照顺序排好，分别给每一种酶一个,编号,。,酶的系统编号,：,4,位数字,第一位：,代表六大类反应类型,第二位：,亚类,（作用的,基团或键,的特点）,第三位：,亚亚类,（精确表示底物,/,产物的性质）,第四位：在亚类中的,序号,例如：乳酸脱氢酶,(EC 1,1,1,27),。,练习题：,1,、根据国际系统分类法，所有的酶按所催化的化学反应的性质可分为六类为,、,、,、,、,和,。,2,、根据国际酶学委员会的规定，每一种酶都有一个唯一的编号。醇脱氢酶的编号是,EC1.1.1.1,，,EC,代表,，,4,个数字分别代表,、,、,和,。,国际酶学委员会,酶的分类,亚类,亚亚类,在亚亚类中的编号,五、酶的专一性,（一）酶对,S,的专一性,酶的,专一,性的,类型,结构专一性,绝对专一性,相对专一性,立体专一性,几何异构专一性,旋光异构专一性,族（基团）专一性,键专一性,酶的专一性,（二）关于酶专一性的假说,三点附着学说,三点附着学说,认为酶与底物的,结合处至少有三个点,，而且只有一种情况是完全结合的形式。只有这种情况下，,不对称催化作用,才能实现。,“,锁钥”学说,认为整个酶分子的天然构象是具有,刚性结构,的，酶表面具有,特定的形状,。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。,刚性模式：,Emil Fisher,提出,诱导锲合学说,该学说认为酶表面并,没有,一种与底物互补的,固定形状,，而只是由于,底物的诱导,才形成了,互补形状,.,柔性学说：,Koshland,提出,The induced-fit model,诱导锲合学说,六、酶活力的测定（重点）,（一） 酶活力与酶促反应速度,1.,酶活力,概念：酶催化一定化学反应的能力。,实质：酶催化的,反应速度越快,，,酶活力越高,，反之则表示该酶活力低。,通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速度来表示。,即用,单位时间内，单位体积中底物的减少量或产物增加量来表示,。,2,、表示方法,产物浓度变化曲线,用哪一个速度来表示,酶促反应的速度特征呢？,反应初速度,V,o,反应,初,速度表示酶活力,（二）酶活力单位,常用的酶活力单位有三种：,1,、国际单位,(IU),由国际酶学委员会规定,在标准条件,(25,、最适,pH,、最适底物浓度,),下，酶,每分钟,催化,1,m,mol,底物转化所需的酶量定义为,1,个国际单位,(IU),。,单位：,mol,min,-1,某酶在一定条件下，,5 min,内使,30 mmol,底物转变为产物，问该酶的活力（,IU,）是多少？,思考题：,30mmol,5min,30000,mol,6000,IU,5min,2,、,Katal,是由国际酶学委员会于,1972,年规定的一种新单位,在最适条件下，酶每秒钟催化,1mol,底物转化所需的酶量定义为,1,个,Kat,。,1 Kat = 6010,6,IU,1 Kat = 610,7,IU,3,、自定义的活力单位（了解）,这种单位简单方便，省去了许多计算；但只能进行酶活力的相对比较。,酶习惯上或测定时使用的,反应速度的单位,定义为酶的活力单位。,有的甚至直接用测得的物理量，如单位时间内消光值的变化,(,D,A/t),表示酶活力单位。,-,淀粉酶活力单位,：每小时分解,1g,可溶性淀粉的酶量为一个酶单位,糖化酶活力单位,：在规定条件下，每小时转化可溶性淀粉产生,1mg,还原糖（以葡萄糖计）所需的酶量为一个酶单位。,蛋白酶,：规定条件下，每分钟分解底物酪蛋白产生,1g,酪氨酸所需的酶量。,DNA,限制性内切酶,：推荐反应条件下，一小时内可完全消化,1g,纯化的,DNA,所需的酶量。,1,、有,1g,淀粉酶制剂，用水溶解成,1000ml,，从中取出,1ml,测定酶活力，测知每,5min,分解,0.25g,淀粉。,(,淀粉酶活力单位的定义：在最适条件下每小时分解,1g,淀粉的酶量为,1U),求,1g,酶制剂中所含有的淀粉酶活力单位数,?,思考题：,由题意每小时分解,1,克淀粉的酶量为,1U,，,1ml,酶液,5min,水解,0.25g,淀粉得出：,1ml,该酶液,1,小时可以水解淀粉（,120.25,）,g,3g,，则,1ml,酶液含活力单位数为,3U,，那么,1g,酶制剂含活力单位数为,3U/ml1000ml,3000U,。,（三）酶的比活力,1,、酶的比活力,指,每毫克,酶蛋白所含的,酶活力单位数,比活力 ,酶活力单位数（,U,）,酶蛋白质量（,mg,）,比活力是酶制剂纯度的常用指标,比活力越大,，表示,酶越纯,有,50,g,纯酶制剂，,5min,内催化生成了,4,mol,产物，计算酶的,活力,及,比活力,。,思考题：,酶的,活力,=,4,4,=,0.8 IU,5,酶的比,活力,=,0.81000,4,=,16,U/mg,50,2,、产率与纯化倍数,纯化倍数,=,每次,比活力,/,第一次,比活力,产率,=,每次,总活力,/,第一次,总活力,100%,不同样品同一酶制剂的总活力、总蛋白、比活力比较,纯化,进程,甲,乙,丙,丁,总活力,6,4,3,2,总蛋白,(mg),20,10,5,2,比活力,(U/mg),6/20,4/10,3/5,2/2,从某细胞中提取的一种蛋白水解酶的粗提液,300mL,含有,150mg,蛋白质,，,总活力为,360,单位,。经过一系列纯化以后得到的,4mL,酶制品,(,含有,0.08mg,蛋白,),，,总活力为,288,单位,。请问,回收率,是多少？,纯化,了多少倍？,思考题：,第一次酶的比活力,=,360,=,2.4,150,最后酶的比活力,=,288,=,3600,0.08,产率,=,每次,总活力,/,第一次,总活力,100%,288/360,80,纯化倍数,=,每次,比活力,/,第一次,比活力,3600/2.4=1500,P147,第,10,题,某酶的粗提液经过一次纯化后测得数据如下表所示：,步骤,体积,/mL,总蛋白,/mg,单位体积活力,/,（,IU/mL,）,细胞匀浆（粗提液）,100,1000,20,亲和层析,5,10,300,试计算该酶的比活力、纯化倍数和回收率？,最终酶的比活力,=(300,5)/10=150IU/mg,最初的比活力,=(20,100)/1000=2IU/mg,纯化倍数,=150,/2=75,回收率,=,（,300,5,）,/,（,20100,）,=75%,（五）酶活力的测定（了解）,测定完成一定反应所需的时间,测定单位时间内酶催化的化学反应量,（,1,）分光光度法：,利用底物,/,产物光吸收性质不同,选择适当波长来测定。,（,2,）荧光法：,利用底物,/,产物荧光性质的差别。,紫外,/,可见光,（,3,）同位素测定方法：,放射性同位素标记底物，,经酶作用得到相应产物，,经适当分离，测定产物脉冲数即可。,（,4,）电化学法：,包括,pH,测定法，离子选择电极法等。,前者跟踪反应过程中,H,+,的变化，,后者用氧电极测定一些耗氧的酶反应。,七、核酶,-,非蛋白质生物催化剂,（一）核酶的发现（,ribozyme,）,）,核酶是,具有催化功能的,RNA,分子，是生物催化剂,，可降解特异的,mRNA,序列。,它的发现打破了酶是蛋白质的传统观念。有一些被,DNA,分子同样具有催化功能。,（二）核酶的种类（自我催化）,剪切型核酶,（,self- cleavage,）,-,是转录后加工方式之一,剪接型核酶,（,self-splicing,）,-,剪切与连接,需要鸟苷和,Mg,2+,参与,不需要鸟苷的参与,其他类型,-,如核苷酸转移，脱磷酸作用,（三）核酶的研究意义,RNA,可作为,生物催化剂,。,打破了只有蛋白质才能有酶催化作用。,为进化先有核酸、先有,RNA,提供证据。,可用于制药和临床治疗。,内容回顾,酶的活力及比活力及如何计算,指,每毫克,酶蛋白所含的,酶活力单位数,比活力 ,酶活力单位数（,U,）,酶蛋白质量（,mg,）,第二节 酶动力学,酶促反应动力学,研究,各种因素,对酶促反应,速度,的影响。,影响因素包括有,酶浓度、,底物浓度,、,pH,、温度、,抑制剂,、激活剂等。,酶动力学,一、有关的化学动力学概念（了解）,化学反应的两个基本问题：,反应进行的,方向、可能性和限度,-,化学热力学,反应进行的,速率和反应机制,-,化学动力学,1.,反应分子数,反应中真正相互作用的分子的数目,单分子反应：,A,P,双分子反应：,A+B,P+Q,2.,反应级数,能以,v =,k,c,表示，为,一级,反应；,能以,v =,k,c,1,c,2,表示，则为,二级,反应；,v,与反应物浓度无关，则为,零级,反应。,双分子反应、一级反应,二,.,底物浓度对酶促反应速率的影响,（一）中间复合体学说,研究前提,单,底物、,单,产物反应；,酶促反应速度一般在规定的反应条件下，,用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示；,反应速度取其,初速度,，即底物的,消耗量很小,（一般在,5,以内）时的反应速度；,底物浓度,远远大于,酶浓度。,（,S E,）,1.,中间复合体学说,E + S ES P + E,k1,k2,k3,k4,三个假设：,（,1,）,E,与,S,形成,ES,复合物的反应是,快速平衡,反应，而,ES,分解为,E,及,P,的反应为,慢反应,，反应速度取决于,慢反应即,V,k,3,ES,。,（,2,）,S,的总浓度,远远大于,E,的总浓度，因此在反应的初始阶段，,S,的浓度可认为不变即,S,S,t,。,（,3,）,P0,忽略 这步反应,+,+,中间复合体学说,2.,底物浓度对酶促反应速度的影响,在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。,E + S,k,1,k,2,k,3,ES,E + P,S,V,Vmax,当底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比；反应为,一级反应,。,S,V,Vmax,随着底物浓度的增高,反应速度不再成,正比例,加速；反应为混合级反应。,S,V,Vmax,当底物浓度高达一定程度,反应速度不再增加，达,最大速度,；反应为,零级,反应,S,V,Vmax,（二）酶促反应动力学的基本公式,米,-,曼氏方程,1,、米氏方程及其推导,1913,年,Michaelis,和,Menten,在,快速平衡理论,的基础上,提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，简称米氏方程式,(Michaelis equation),，,1925,年,Briggs,和,Haldane,在,稳态平衡理论,的基础上并对米化方程进行了修正，但为纪念仍称米氏方程,。,S,：底物浓度,V,：反应速度,V,max,：最大反应速度,m,：米氏常数,1913,年,Michaelis,和,Menten,提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米曼氏方程式，简称米氏方程,(Michaelis equation),。,S,：底物浓度,V,：不同,S,时的反应速度,V,max,：最大反应速度,(maximum velocity),m,：米氏常数,(Michaelis constant),V,max,S,K,m,+ S,米氏方程的推导,令,：,将,（,4,）,代入,（,3,）,，则,：,ES,生成速度,：,，,ES,分解速度,：,即,：,则,：,(1),经整理得,：,由于酶促反应速度由,ES,决定，即,，,所以,(2),将,（,2,）,代入,（,1,）,得,：,(3),当酶反应体系处于,稳态,时,：,当,Et=ES,时,，,(4),所以,米氏常数,最大反应速度,a.,当,S,很小时,V=VS/Km,一级反应,反应,初速度,随底物浓度变化曲线,米氏曲线,V=,V,S,Km + S,b.,当,S,很大时,V=,V,S/S=,V,0,级反应,混合级,2,、米氏方程所确定的曲线,3,、,K,m,值的推导,、定义及意义,当反应速度为最大反应速度一半时,K,m,S,* K,m,值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是,mol/L,。,2,K,m,+ S,V,max,V,max,S,V,max,V,S,K,m,V,max,/2,Km,的意义,K,m,值是酶的,特征性常数之一,，但,不同条件下具有不同的,Km,值。,K,m,值可表示,酶与底物之间的亲和程度,同一种酶对不同底物有不同的,Km,值，可帮助,推断某一代谢反应的方向和途径,Km=,k2 + k3,k1,Kmk2,（分离能力）,/k1,（亲合能力）,E + S ES P + E,k1,k2,k3,Km,越,小,，亲和力越,强。,S,很小时，反应速度就能达到很大。,性能优，代谢中这类酶更为重要,k2,k3,时,Km,值表示酶与底物之间的亲和程度,Km,值可以判断酶的专一性和天然底物,：,有的酶可作用于几种底物，因此就有几个,Km,值，其中,Km,值最小的底物称为该酶的最适底物,，,也就是天然底物。,Km,愈小，达到最大反应速率一半所需要的底物浓度就愈小,，,底物最适。,Km,值表示酶与底物之间的亲和程度,Km,值可以帮助推断某一代谢反应的方向和途径,在可逆反应中，两个,Km,值中最小,的反应方向是该酶促反应的,主要方向,.,如果代谢途径各酶的,Km,已知，,Km,最大,的酶是,限速酶,.,4,、,Vmax,和,k,3,（,k,cat,),的意义,定义：,V,max,是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成,正比。,意义：,V,max,=K,3,E,如果酶的总浓度已知，可从,V,max,计算,酶,的转换数,，即动力学常数,K,3,。,即单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。,底物浓度对酶促反应速率的影响,S,V,Vmax,内容回顾,Km,的概念及意义,概念：当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度,.,物理意义：酶的,特征性常数,，只有酶的性质有关，与酶的浓度无关,.,5,、,Km,和,V,max,的测定,（,1,）,Lineweaver-Burk,双倒数作图法,将米氏方程改写成：,1/,Vmax,斜率=,Km/Vmax,-1/,Km,（,2,）,v,对 作图（,Eadie-Hofstee,法）,Eadie-Hofstee,方程式：,（,3,）,S/v,对,S,作图（,Hanes-Woolf,法）,小结,米氏方程,根据下图所给出的动力学数据，查出该酶的,Km,值是多少？（ ）,思考题：,-4 -2 0 2 4 6,7,6,5,4,3,2,1,1/S,1/v,借助米,-,曼氏方程,VmaxS/(Km,S),研究底物浓度对酶反应速度影响的一种有用的方法是，在规定的实验条件下检验这个方程。在下述条件下，方程呈什么形式？,当,S=Km,时；,当,SKm,时；,当,SKm,时。,米氏常数随酶浓度增加而变大。（ ）,酶促反应的米氏常数与所催化反应的底物无关（ ）,.,三,.,多底物的酶促反应（了解）,1.,酶促反应按底物分子数分类,分为单底物、双底物和三底物反应,2.,多底物反应按动力学机制分类,（,1,）序列反应或单置换反应,随机单置换反应（,random reactions,）,如肌酸激酶使肌酸磷酸化的反应,A,B,有序反应（,ordered reactions,）,领先,底物,释放,释放,A,和,Q,竞争地与自由酶结合,(2),乒乓反应或双,置换,反应,A,AE PE,P,E E,Q,EQ EB,B,A,和,Q,竞争自由酶,E,形式,B,和,P,竞争修饰酶形式,E,A,和,Q,不同,E,结合,B,和,P,也不与,E,结合。,A,Q,3.,双底物反应的动力学方程,（,1,）,序列机制,的底物动力学方程及动力学图,在,B,的浓度达到饱和时,A,的米氏常数,在,A,的浓度达到饱和时,B,的米氏常数,底物,A,与酶结合的解离常数,底物,A,、,B,都达到饱和时最大反应速率,（,2,）乒乓机制的底物动力学方程及动力学图,在,B,的浓度达到饱和时,A,的米氏常数,在,A,的浓度达到饱和时,B,的米氏常数,底物,A,、,B,都达到饱和时最大反应速率,四、,影响酶促反应速率的其他因素,影响酶促反应速度的因素：,酶浓度,E,底物浓度,S,pH,反应温度,激活剂,A,抑制剂,I,酶浓度对反应速度的影响,当,S,E,，反应速度与酶浓度成正比。,0,V,E,关系式为：,V = K,3,E,（一）,pH,对酶促反应的影响,1,、酶反应的最适,pH,在一定的,pH,下,酶具有最大的,催化活性,通常称此,pH,为最适,pH,。,钟罩形,酶的最适,pH,不是一个固定的常数,，它受到底物的种类、浓度,;,缓冲液的种类、浓度,;,酶的纯度,;,反应的温度、时间等的影响。,例,:,碱性磷酸酶催化磷酸苯酯水解时,s,为,2.5x10,-5,M,，最适,pH,为,8.3,s,为,2.5x10,-2,M,，最适,pH,为,10.0,2,、,pH影响反应速度的原因,极端的,pH,引起酶蛋白的,变性,，因而使酶的,活力丧失,；,pH,的改变影响酶分子上酸性及碱性,AA,残基的,侧链基团的解离状态,；,pH,的改变也影响,底物的解离状态,。,（二）温度对酶促反应的影响,上图反映出温度如何影响酶活力？,产物累积量,相对酶活力,最适温度,最适温度,动物酶,3540,植物酶,4050,微生物,大部分,4050,个别高温菌,90,以上,最适温度（,optimum temperature,）,酶表现,活力最大,时的温度为最适温度,最适温度不是一个固定的常数,，它随底物的种类、浓度,溶液的离子强度, pH,反应时间等的影响。,例,:,反应时间短，最适温度高。,反应时间长，最适温度低。,（三）激活剂对酶促反应的影响,1,、概念：,使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。,2,、种类：,大多数的,无机离子,、一些小分子的,有机化合物,以及,生物大分子。,-,必需激活剂,(essential activator),-,非必需激活剂,(non-essential activator),五、酶的抑制作用（重点）,（一）抑制作用的概念,1,、概念,凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的抑制剂。,抑制剂对酶有一定选择性，而变性的因素对酶没有选择性。,失活作用,：使酶,Pr,变性而引起酶活力丧失。,抑制作用,：使酶活力下降但不引起变性。,2,、抑制与失活的比较,3,、抑制程度的表示方法（了解）,（,1,）相对活力,V,i,V,0,V,i,：有,I,存在下的反应初速率,V,0,：无,I,时的初速率,2.,抑制分数,指被抑制而失去活力的分数,V,i,V,0,（二）抑制作用的类型（掌握）,根据抑制作用是否可逆,:,1,）不可逆抑制作用,:,抑制剂与酶的必需基团以,共价键结合,而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活的作用,.,2,）可逆抑制作用,:,抑制剂与酶以,非共价键,结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活，抑制作用是,可逆,的,.,（三）可逆性抑制作用,三种类型,竞争性抑制,非竞争性抑制,反竞争性抑制,1,、竞争性抑制,（,1,）竞争性抑制作用,定义,：,抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。,竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。,竞争性抑制剂,（,2,）竞争性抑制剂的动力学曲线,S,S,E,E,I,I,E,E,+ P,无,I,有,I,竞争性抑制的底物浓度曲线,v,竞争性抑制作用过程,S,抑制剂常数,有竞争性抑制剂存在时，,Km,值增大,(1+I/Ki),倍，且,Km,值随,I,的增高而增大；,在,E,固定时，当,S Km (1+I/Ki), Km (1+I/Ki),项可忽略不计，则,v= Vmax,，即最大反应速度不变。,竞争性抑制作用的速度方程：,v=,VmaxS,Km(1+I/Ki)+S,1v,=,Km Vmax,(1+ ) +,IKi,1 S,1 Vmax, I ,正常,1v,1 S,1 Vmax,-1,Km(1+ ),I Ki,-1 Km,竞争性抑制动力学曲线,（,3,）竞争性抑制作用的特点,I,与,S,分子结构相似；,V,max,不变，,Km,增大；,抑制程度取决于,I,与,E,的亲和力 以及,I,和,S,的相对比例；,增大,S,可减轻或消除抑制作用,.,（,4,）竞争性抑制作用的例子,琥珀酸,延胡索酸,草酸盐,草酰乙酸,丙二酸,戊二酸,琥珀酸脱氢酶,FAD,例,1:,丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制,例,2,：,磺胺药对细菌,FH,2,合成酶的抑制,例,3.,抗代谢物的抗癌作用,内容回顾：,底物浓度对酶促反应速度的影响,酶浓度对反应速度的影响,当,S,E,，反应速度与酶浓度成正比。,0,V,E,关系式为：,V = K,3,E,根据抑制作用是否可逆,:,1,）不可逆抑制作用,:,抑制剂与酶的必需基团以,共价键结合,而引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活的作用,.,2,）可逆抑制作用,:,抑制剂与酶以,非共价键,结合而引起酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活，抑制作用是,可逆,的,.,抑制剂对酶促反应速度的影响,可逆性抑制作用,三种类型,竞争性抑制,非竞争性抑制,反竞争性抑制,1,、竞争性抑制,竞争性抑制作用,定义,：,抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。,竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。,竞争性抑制动力学曲线,2,、非竞争性抑制,概念 抑制剂与酶分子,活性中心以外,的必需基团结合而抑制酶活性，,I,和,S,之间不存在竞争关系。,（,1,）非竞争性抑制作用,非竞争性抑制剂,S,S,E,E,E,E + P,S,E,S,I,I,I,I,（,2,）非竞争性抑制作用的动力学曲线,经推导后得方程,:,有非竞争性抑制剂存在时，,V,值减小,(1+I/Ki),倍，且,V,值随,I,的增高而降低；,Km,值不变。,非竞争性抑制作用的速度方程：,非竞争性抑制的动力学方程,:,1v,=,Km Vmax,(,1+,),+,IKi,1 S,1 Vmax,（,1+,）,IKi,非竞争性抑制的特征曲线：,1v,正常, I,1 S,-1 Km,1 Vmax,(1+ ),IKi,非竞争性抑制动力学曲线,（,3,）非竞争性抑制作用的特点,I,与,S,分子结构不同；,Vmax,减小，,Km,不变；,抑制程度取决于,I,大小。,不能通过增大,S,的方法来消除,3,、反竞争性抑制,（,1,）反竞争性抑制作用,抑制剂不能与游离酶结合，但可与,ES,复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低，称酶的,反竞争性抑制,。,（,2,）反竞争性抑制作用的动力学曲线,有反竞争性抑制剂存在时，,Km,和,Vmax,值均减小,(1+I/Ki),倍，且都随,I,的增高而降低,。,反竞争性抑制的动力学方程,:,v=,VmaxS,Km +(,1+I/Ki,) S,1v,=,Km Vmax,(,1+,),IKi,1 S,1 Vmax,反竞争性抑制的特征曲线：, I ,正常,1v,1 S,1 Vmax,-1,Km,I Ki,+,(,1+,),-1 Km,1 Vmax,(,1+,),I Ki,反竞争性抑制动力学曲线,（,3,）反竞争性抑制作用的特点,I,与,S,分子结构不同, I,只与,ES,结合,Vmax,和,Km,都减小；,抑制程度取决于,I,和,ES,二者的浓度。,底物的存在是抑制剂与酶结合的先决条件,总结,小结：不同类型可逆抑制作用的米氏方程和常数,小结：,K,m,变大,、,V,max,不变,截距,K,m,不变,、,V,max,变小,K,m,、,V,max,都变小,（四）酶抑制剂应用举例,1.,不可逆抑制剂的概念及类型,概念：,抑制剂与酶的必需基团以,牢固的共价键结合,使酶丧失活性,不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性,.,非专一性不可逆抑制剂,不可逆抑制剂,专一性不可逆抑制剂,不可逆抑制剂,非专一性,不可逆抑制剂,（作用于一,/,几类基团）,专一性,不可逆抑制剂,（作用于某一种酶的,活性部位基团）,非专一性不可逆抑制剂,-OH,例,1,： 巯基酶的抑制,SH,S,E + Hg,2+,E Hg + 2H,+,SH,S,解毒方法：,S,E Hg +,S,COONa,CH,SH,CH,SH,COONa,SH,E + Hg,SH,COONa,CH,S,CH,S,COONa,二巯基丁二酸钠,例,2,： 羟基酶的抑制,有机磷化合物 羟基酶 磷酰化酶,(,失活,),酸,RO O,RO OE,磷酰化酶,(,失活,),O OR,O OR +EOH,解磷定,专一性不可逆抑制剂,特点：抑制剂只作用于酶蛋白分子中,一种,AA,侧链基团,或仅作用于一类酶。,Ks,型不可逆抑制剂,K,cat,型不可逆抑制剂,类型：,根据底物的化学结构设计，具有底物类似的结构，可以和相应的酶结合，同时还带有,一个活泼的化学基团,，能与酶分子的,必需基团反应进行化学修饰,，从而抑制酶的活性。,类型一：,Ks,型不可逆抑制剂（亲和标记型）,二者有相似的结构，,TPCK,可以与,胰蛋白酶活性部位必需基团,His,57,共价结合，引起不可逆地失活。,TLME,（对甲苯磺酰,-L-,赖氨酰甲酯）,TPCK,（对甲苯磺酰,-L-,赖氨酰氯甲酮）,K,cat,型不可逆抑制剂（自杀性底物）,与底物结构类似，但分子中还有,潜伏的反应基团,。当它与底物结合后，其潜伏的反应基团被酶催化而活化，并,立即与酶活性中心某基团呈不可逆结合，,使酶遭受抑制。此类抑制剂亦称酶的自杀性底物,。,Hg,2+,对酶的抑制作用可用下列哪种方法解除,?,A,：提高底物浓度,B,：对,pH7.4,磷酸盐缓冲液进行透析,C,：使用解磷定,D,：使用二巯基丙醇,思考题：,2,、,可逆抑制剂应用的例子,（,1,）竞争性抑制剂的例子,利用竞争性抑制是药物设计主要思路,磺胺类药,抗菌机理：,-,与对氨基苯甲酸是结构类似物,竞争性抑制细菌叶酸形成，抑制细菌繁殖。,人通过食物直接补充叶酸，对人无毒害。,3,、可逆和不可逆抑制作用的鉴别,反应体系不加,I,体系中加入一定量不可逆抑制剂,体系中加入一定量可逆抑制剂,v,1,2,3,E,E,v,不可逆抑制剂,的作用,E,v,可逆抑制剂,的作用,I,I,思考题：,如何根据,酶反应速度,与,酶浓度,的关系作图区分,可逆抑制剂,与,不可逆抑制剂,？,1,、可逆抑制作用,2,、不可逆抑制作用,3,、两种抑制剂有不同的动力学曲线,E,v,不可逆抑制剂,的作用,E,v,可逆抑制剂,的作用,I,I,第三节,酶作用机制和酶活性调节,第三节 酶作用机制和酶活性调节,一、酶的活性部位及其确定方法,二、酶促反应机制,三、酶促反应机制的举例,四、酶活性的别构调节,一、,酶的活性部位及其确定方法,1,、酶的活性部位（或中心）,（,1,）概念：指酶分子中,直接参与和,S,结合,，并与,酶催化作用直接相关,的部位。,（,2,）类型：,结合部位,和,催化部位,结合部位,：参与,S,结合的部位，决定酶促反应的专一性；,催化部位,：直接参与催化反应的部位，决定酶促反应的性质,.,活性中心的,结合部位,S,E,活性中心的,催化部位,（,3,）结构特征,占据的空间位置,很小,，一个三维实体；,活性中心的构象具有,柔韧性和可塑性,；,活性中心,AA,残基一级结构可能相距很远，通过肽链折叠空间,构象上靠近,；,活性部位是,E,分子表面的一个空穴或裂沟（,疏水空穴,）,.,通过次级键与底物结合，并与底物,诱导契合,。,活性中心,AA,残基一级结构可能相距很远，通过肽链折叠空间构象上靠近,溶菌酶,2,、维持活性所,必需,的氨基酸残基,酶的必需基团：,概念：与酶的,催化活性直接相关,的化学基团，若经化学,修饰,则酶的,活性丧失,。,类型：,His,的,咪唑基,、,Ser,的,-OH,、,Glu,的侧链,-,COOH,、,Cys,的,-SH.,小结：活性部位与必需基团的关系,必需基团,活性部位,维持酶的空间结构,结合部位,催化部位,专一性,催化性质,3,、活性中心存在的实验证明（了解）,切除法,化学修饰法,亲和标记法,X-射线衍射技术,化学修饰法,原理：,用某些化学试剂与酶分子,侧链基团,以共价键结合，观察,酶的活性,改变，以确定活性中心的氨基酸残基。,如果共价,修饰后,酶活性,不受影响,，则修饰的氨基酸残基,不是活性中心内,；,如果酶活性,丧失或降低,，则修饰的氨基酸残基,可能位于活性中心内,。,举例：,胰凝乳蛋白酶的活性中心的确定,丝氨酸蛋白酶,DFP,二异丙基氟磷酸,亲和标记法,原理：根据,E,与,S,能,特异性结合,的性质，设计合成一种含有反应基团的,S,类似物,，可与,S,一样进入,E,的活性中心，通过,共价结合而使酶失去活性,.,+,X,-,Y,3,9,胰凝乳蛋白质酶的亲和标记法测定活性中心,S,对甲苯磺酰,L-,苯丙氨酸氯甲酮,X-射线衍射技术,二,.,酶促反应机制,基元催化的分子机制,酶具有高催化能力的原因,酸碱催化,共价催化,金属离子催化,邻近和定向效应,诱导契合和底物形变,电荷极化和多元催化,疏水的微环境的影响,（一）基元催化的分子机制（了解）,1.,基元催化的概念,-,由某些,基团或小分子,催化反应的，包括酸碱催化、共价催化和金属离子催化。,亲电催化剂,-,缺电子的原子或基团，倾向于从,S,的多电子基团,接纳电子,。,亲核催化剂,-,具有,未共享电子对,的基团，倾向于向,S,的缺电子的核,提供电子,。,2.,酸碱催化,通过暂时性地向,S,提供,H,+,或从,S,接纳,H,+,以稳定过渡态的一种催化机制。,特殊的酸碱催化,-OH,-,与,H,+,的反应,一般或广义的酸碱催化,为,Tyr,248,为,Arg,145,为,Glu,270,为底物,Zn,羧肽酶活性中心示意图,3.,共价催化,亲电基团,-Mg,2+,、,Mn,2+,（有空轨道）,亲核基团,-,酶活性中心,亲电,/,亲核基团,参与,S,敏感键断裂的机制。,-OH,-SH,(,有孤对电子,),4,、金属离子催化,（,1,） 金属酶,(metalloenzyme),含,紧密结合,的金属离子（常为活性中心的组成部分）,（,2,）金属激活酶,( metal-activited enzyme),含,松散结合,的金属离子,1),金属离子作为辅助因子的酶的分类,羧肽酶,Zn,2+,2,）金属离子催化作用的机制,提高水的亲核性能,电荷屏蔽作用,电子传递中间体,（二）酶具有高催化能力的原因,1,、 邻近与定向效应,2,、 诱导契合与底物形变,3,、 电荷极化和多元催化,4,、 疏水的微环境的影响,1,、 邻近与定向效应,靠近,电性吸引、疏水作用,定向,底物,酶,一个,分子间,的反应变成了一个类似,分子内,的反应,2,、 诱导契合与底物形变,诱导,互补性结构变化,契合,活性中心催化基团进行催化,能否契合,专一性的由来,+,-,+,-,稳定的底物,通过电荷等相互作用，底物张力变形激活形成过渡态,张力与形变,-,-,+,+,3,、 电荷极化和多元催化,胰凝乳蛋白酶分子中催化三联体构象,His57,Asp102,Ser195,Asp102,His57,Ser195,His57,102,Asp,Ser195,A.,酶分子中的电荷中继网,B.,加上底物后，从,Ser,转移一个质子给,His,，带正电荷的咪唑基通过带负电荷的,Asp,静电相互作用被稳定,Ser195,102,Asp,His57,底物,酶分子的活性中心是位于非极性的空穴中。,非极性的空穴有利于提高酶促底物反应速度。,4,、 疏水的微环境的影响,疏水性“口袋”效应,疏水口袋,肽链,底物,三,.,酶促反应机制的举例,1,、羧肽酶,A,的结构及催化机理,活性中心必需的氨基酸：,Glu270,、,Arg71,、,Arg127,、,Arg145,、,Tyr248,金属离子：,Zn,2+,催化机制：,诱导契合,、锌离子的,亲电催化,、,酸碱催化,以及,Arg127,的,静电吸引,作用,羧肽酶,A,羧肽酶催化中的电子云形变,C,=O,靠近,电子云形变,定向,极性专一性契合区,H,2,+,N,C,精氨酸,C,端确认区,注意,羧肽酶,A,的催化机理,2,、胰凝乳蛋白酶的催化机理,底物：选择性降解,带芳香环侧链,的氨基酸和大的,疏水侧链,的氨基酸,活性中心的必需氨基酸：,Ser195,、,His57,、,Asp102,催化机制：一般的,酸碱催化,和,共价催化,3,、烯醇化酶,作用需要金属离子,2-,磷酸甘油酸,磷酸烯醇丙酮酸,烯醇化酶,碱催化,稳定中间产物,酸催化,四,.,酶活性的别构调节,1,、别构调节和别构酶,别构调节,：,酶分子的,非催化部位,与某些化合物,可逆,地,非共价,结合后发生,构象的改变,，进而改变,酶活性,状态。,别构酶,：,具有别构现象的酶。,别构剂,：,能使酶分子发生别构作用的物质。,活性中心,调节中心,2,、协同效应,（,1,）概念：,当别构酶的一个亚基与其配体（底物或别构剂）结合后，能够通过,改变相邻亚基的构象,而使其对配体的亲和力发生改变，这种效应就称为别构酶的协同效应。,如果对相邻亚基的影响是导致其对配体的亲和力增加，则称为,正协同效应,；反之，则称为,负协同效应,。,如果是,同种配体,所产生的影响，则称为,同促协同效应,。如果是,不同配体,之间产生的影响则称为,异促协同效应,。,（,2,）类型,3,、别构酶的特点,（,1,）一般是,寡聚酶,，由多亚基组成，包括,催化,部位和,调节,（别构）部位；,（,2,）具有,别构效应,（,3,）别构酶的底物浓度对酶促反应速度的曲线,不符合米氏方程,，呈,“,S”,形,曲线。,S,曲线：正,协同,81,V,随,S,而,加快,双曲线：负,协同,81,V,随,S,而,减慢,4,、别构酶与米氏酶的区别,怎么区分米氏酶与别构酶？,（,1,）,Koshland,建议用饱和比值（,saturation ratio, Rs,）,典型的米氏酶,R,S,=81,具有正协同效应的别构酶,R,S,81,具有负协同效应的