感染性疾病的分子诊断PPT通用课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八、九章感染性疾病的分子诊断,感染的慨念,感染是病原体和人体之间的相互作用过程,病原微生物：致病菌（条件致病菌）,微,生,物,人,体,微,生,物,人,体,不,同,的,感,染,状,态,共,生,状,态,在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生,感染性疾病,：由某种病原体所致，通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病。,病原体,：病毒、细菌、原虫、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、,寄生虫,。,常规检测方法：,免疫学方法,微生物学方法,受敏感性、特异性限制，不易早期诊断，并且不易提供病原体分型及耐药性方面的信息。,感染性疾病的分子诊断策略,一般性策略（检出病原体）：,判断有无感染,是何种病原体感染,常用方法：,PCR, 杂交,完整性策略：,检出,病原体,分型（分类）亚型耐药性,常用方法：杂交、,PCR,、基因芯片、,DNA,测序,感染性疾病分子诊断标志物,病原体核酸分子（,DNA/RNA,）,基因表达产物,代谢物,免疫应答分子,细,胞,免,疫,体,液,免,疫,T,T,致敏,T,细胞,淋巴因子,B,浆细胞,IgM,IgG,IgA,IgD,IgE,感染早期出现,临近恢复期出现,与原虫和蠕虫感染有关,二、感染性疾病分子诊断的常用方法,根据,目的基因,是否被放大，,可分为杂交法和扩增法。,信号放大技术检测方法,靶分子数目不变，而检测的探针信号放大,采用多酶、多探针,或,二者结合等方法来增加探针标志物的浓度使检测信号得到放大。,靶分子扩增技术检测方法,靶分子（,RNA,、,DNA,或探针）的扩增,PCR,、替代扩增、,LCR,等,引物,A,靶,RNA,引物,B,RNA,cDNA,RT,3,5,5,5,3,5,3,5,3,cDNA,cDNA,模板,5,5,3,3,5,3,引物,B,RNAseH,RT,T,7,RNA,聚合酶,100-1000 RNA,扩增子,5,3,5,3,3,5,3,5,引物,A,3,5,5,RNAseH,RNA,RNA,cDNA,cDNA,图,8-3 NASBA,原理示意图,引物,A,5,端带有,T7RNA,聚合酶结合位点，,3,端碱基与靶,RNA 3,端序列互补,;,引物,B,的碱基序列与,cDNA 3,端序列互补,nucleic acid sequence-based amplification (NASBA),NASBA,的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于,PCR,，特异性好。,引物,A,靶,RNA,引物,B,RNA,cDNA,RT,3,5,5,5,3,5,3,5,3,cDNA,cDNA,模板,5,5,3,3,5,3,引物,B,RNAseH,RT,T,7,RNA,聚合酶,100-1000 RNA,扩增子,5,3,5,3,3,5,3,5,引物,A,3,5,5,RNAseH,RNA,RNA,cDNA,cDNA,图,8-3 NASBA,原理示意图,引物,A,5,端带有,T7RNA,聚合酶结合位点，,3,端碱基与靶,RNA 3,端序列互补,;,引物,B,的碱基序列与,cDNA 3,端序列互补,nucleic acid sequence-based amplification (NASBA),NASBA,的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种 酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于,PCR,，特异性好。,三、感染性疾病分子诊断的标本处理,标本采集处理主要包括选择合适的标本种类、标本量、抗凝剂等及对标本进行合适的传送、保存和预处理。,四、感染性疾病分子诊断的结果解释,1.,阴性结果,假阴性可能性,方法的灵敏度太低,方法失败,目标分子,2.,阳性结果,假阳性可能性,方法的特异性,受到污染,3.,定性检测结果,有时不能提供病原体活力相关信息,临床治疗病情缓解后一定时间内，在患者样本中仍可以检测出相应的病原体。,有些病原体潜伏在进体内，没有临床症状。,4.,疾病状况的判断,检测出病原体的存在并不能说此病原体就是引起疾病的直接原因。,该病原体可能是一种正常菌群,五、感染性疾病分子诊断的临床应用及评价,用于感染性疾病治疗的监控和预测、病情发展过程的危险性评价及疾病预后等。,耐药性的检测,细菌的分型,流行病调查,第一节 病毒的基因检测,人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、脑炎、流行性感冒等等，占人类传染疾病的,75%,左右。,400,多种不同病毒。,病毒结构：大 小：,20-300nm,核心区：核酸（,DNA,或,RNA,）,外周衣壳：蛋白质,包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）,我国是,HBV,高流行区，,50%,70%,的人受过感染，,8%,10%,是,HBV,携带者，肝炎患者中,60%,是慢性肝炎患者，导致肝硬变，,HBV,又与原发性肝癌密切相关。,外壳（,HBsAg):,外壳蛋白成分为表面抗原,核心（,HBcAg),：,DNA,DNA,聚合酶,HBcAg,一、 乙型肝炎病毒,Dane,颗粒（完整的病毒）形态,HBsAg,HBcAg,HBV DNA,DNAPol,（外膜蛋白）,（核衣壳蛋白）,完整的乙肝病毒颗粒直径,42,纳米,由双层外壳和一个核心组成的，核心直径为,27,纳米， 内含,DNA,双链和,DNA,多聚酶,（一）病毒基因组结构,3.2kb,双链,DNA,病毒,不完全双连环状,DNA,长链,L,为负链：有,4,个开放阅读框,S,、,C,、,P,、,X,S,区编码外膜蛋白（,HBsAg,）,C,区编码,HBeAg,、,HBcAg,p,区编码,DNA,聚合酶,X,区位编码,X,蛋白，可能与病毒蛋白表,达有关。,短链,S,为正链：长短不一,pre-s1,pre-s2,S,P,C,pre-c,X,HBV DNA 3.2 kb,pre-S1,pre-S1,蛋白,pre-S2,pre-S2,蛋白,S,HBsAg,pre-C,HBeAg,C,HBcAg,P,DNAP,X,HBxAg,HBV,基因组结构,HBV,基因分型,HBV,基因序列差异的多少，可将,HBV,划分为不同的基因型，至今为止已发现,A,、,B,、,C,、,D,、,E,、,F,、,G,、,H,共,8,种基因型：,A,型主要存在于白人，,B,型和,C,型主要存在于亚洲人群,E,型主要存在于西非,F,型仅见于中南美洲的土著人,G,型和,H,型很少见,不同基因型序列长度不同，主要是前,S1,区的不同。我国流行的主要是,B,和,C,基因型，长江以北以,C,型为主，长江以南以,B,型为主，另又少量的,A,型、,D,型和混合型。西北和西南尤其是西北有较高比例的,D,型,HBV,在肝细胞内的复制,A(n),mRNA,cccDNA,HBsAg,包膜,负,链DNA,包,裹,后,的,前,基,因,mRNA,传染性,HBV,病毒颗粒,传染性,HBV,病毒颗粒,部分双链,DNA,逆转录酶,DNA,聚合酶,肝 细 胞,（二）分子诊断,常用的免疫学检测方法，即二对半的检测存在窗口期，不易早期诊断。,1.PCR,采用普通,PCR,、,FQ-PCR,、竞争性,PCR,、免疫杂交,PCR,，可提供直接、准确的病原学诊断证据。引物是根据,S,、,C,、,P,、,X,基因中高度保守序列设计，决定扩增的特异性和敏感度。,扩增位置 引物序列 扩增片断（,bp),P,、,X,基因,5,-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3,278,5,-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3,C,基因,5,-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3,477,5,-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3,C,基因,5,-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3,258,5,-ATGGGATCCCTGGAATGCGGGTCTTCCAAA-3,有时为了证实扩增产物的特异性，对扩增产物进行以下分析：,RLFP,斑点杂交,Southern,杂交,2.,支链,DNA,信号放大技术,(bDNA,）,原理,:,捕获探针,检测 靶探针,1,体系 靶探针,2, bDNA,分子,:DNA,主链上结,合多个侧链,捕获探针固化在微孔板上,靶探针,1,分别与捕获探针及待测核酸杂交,靶探针,2,分别与待测核酸及,bDNA,杂交,形成复合物：,固相支持物,捕获探针,靶探针,1,CEs,待测核酸,靶探针,2,LEs,bDNA,复合物,分支链,DNA,信号放大技术,(bDNA),信号检测：,bDNA,可结合很多酶标探针，酶催化底物（,1,2-,二恶二酮，,dioxetane,）发光，使核酸信号放大，且发光强度与,DNA,量成正比。,优点：放大倍数确定,阳性检出率高,稳定性和可重复性好,操作简便，省时，易于普及,3.,基因芯片技术,标本经,PCR,扩增后与芯片上的特异探针进行杂交，可以检测：,是否有病毒感染,感染病毒的种类及亚型,病毒的耐药情况,特点：可同时进行大量标本的检测,近年来陆续上市的,核苷,(,酸,),类似物,对,HBV,的治疗压力集中在,P,区。,干扰素,治疗对,HBV,的压力主要集中在前,C/C,区及前,S,区。,HBV,耐药突变,lamivudine,adefovir,entecavir,telbivudine,YMDD,(,酪氨酸,-,蛋氨酸,-,天冬氨酸,-,天冬氨酸,),HBV,对拉米夫定耐药是,HBV DNA,聚合酶突变所致。,耐药基因位点,(YMDD),位于聚合酶的,C,区,(rtM2041,或,rtM204V),，分别是,YMDD,中的蛋氨酸,(M),被异亮氨酸,(I),或缬氨酸,(V),所替代，形成,YIDD,或,YVDD,变异,.,拉米夫定作用靶位为,HBV DNA,聚合酶,C,区。有研究表明，拉米夫定与,HBV,逆转录酶的亲和力与位于第,552,位氨基酸侧链长度有关，异亮氨酸和缬氨酸取代蛋氨酸，使侧链氨基酸长度缩短，使逆转录酶,dNTP,结合区增大，不适于拉米夫定结合，从而诱发耐药性。,HBV,耐药检测（,YMDD,突变检测方法）,YMDD,突变检测方法,1.,基因测序法,2.,荧光定量,PCR,方法,基本原理,确定探针特定的,TM,值来区分是否突变,常用方法,覆盖突变位点荧光双探针杂交,YIDD YMDD YVDD,46.91 54.64 50.74,（三）临床意义,1.,早期诊断,免疫学检测敏感性：,0.1,g/ml,核酸杂交检测敏感性：,0.1pg/ml,PCR,检测：,0.1fg/ml,因此，在感染早期即可通过,DNA,检测证实病毒的存在。,2.,监测治疗效果,:,HBVDNA10,7,拷贝,/ml,提示病毒复制活跃；,HBVDNA,10,4,拷贝,/ml,治疗有一定疗效；,HBVDNA,10,3,拷贝,/ml,、,HBeAg,阴转、转氨酶正常为乙型肝炎临床治愈指标；,3.,判断病情，指导制定合理的治疗方案,4.,病毒耐药性的检测,乙肝病毒,DNA,聚合酶,YMDD,处的突变是病毒产生耐药性的重要原因，通过监测,YMDD,的突变情况，可以获得病毒耐药性方面的信息，指导抗病毒治疗。,二、流行性感冒病毒,流行性感冒病毒,(Influenza virus),，是引起流行性感冒的病原体,;,分为甲,(A),、乙,(B),和丙,(C)3,个,型别,;,根据病毒颗粒表面,血凝素,(,H,aem,a,gglutinin,，,HA,),和,神经氨酸酶,(,N,eur,a,miridase,，,NA,),的抗原性，甲型流感病毒又可分为不同的,亚型,。,甲型流感病毒易发生变异，致病力强，,1918,年发生在西方国家的大流感杀死了几千万人， 即是由甲型流感病毒引起。,There are 16 different,H,antigens,(H1 to H16) and,nine different N antigens (N1 to N9).,（一）流感病毒基因组结构,单链,RNA,病毒，,RNA,为负链；,有,8,个,RNA,片段或,7,个,RNA,片段；,所有,RNA,片段,5,末端和,3,末端高度保守；,两种不同亚型病毒感染宿主时，会生成基因重配的新病毒；,RNA,基因在复制过程中,常会发生点突变。,（二）分子诊断方法,可采用,RT-PCR,、,FQ-PCR,检测流感病毒,RNA,。引物常按流感病毒保守的非结构基因（,NS,）的序列进行设计。,为证实,PCR,扩增产物的特异性或提高检测的灵敏度，可用限制性内切酶分析法、斑点杂交法、,Southern,印迹法进行扩增产物的分析。,扩增位置 引物序列 扩增片段大小,NS,基因,5,-AAGGGCTTTCACCGAAGAGG-3,190,(bp),5,-CCCATTCTCATTACTGCTTC-3,NS,基因,5,-ATGGCCATCGGATCCTCAAC-3,241,(bp),5,-TGTCAGCTATTATGGAGCTG-3,（三）临床意义,流感病毒的诊断过去主要靠鸡胚羊膜腔培养和血清学血凝抑制试验，这些方法比较费时，灵敏度低，难以作出早期诊断。,PCR,法敏感、特异、简便、快速，并且可用于流感病毒的分型和流行病学调查。,三,.,人类免疫缺陷病毒（,HIV),HIV,，,human immunodeficiency virus,AIDS,，,acquired immunodeficiency syndrome,HIV,为艾滋病的病原体。现已发现引起艾滋病的病毒有,HIV-1,、,HIV-2,、,HIV-3,三种。,1998,年底艾滋病感染者和艾滋病患者总数为,3.340,万，已死亡,1.390,万，是全球十大主要死因之一。,最外层为囊膜，双层脂蛋白，是病毒识别攻击宿主细胞所必不可少的；其内为核衣壳。,2.,基因组结构,逆转录病毒，两个拷贝的单股正链,RNA,；,每个,RNA,长约,9.7Kb,，有,5,帽，,3,端有多聚尾；,HIV,是一种高度变异的病毒；,含有,gag,、,env,和,pol,三个基因以及,6,种调控基因,tat, vif, vpr, vpx, nef, rev,。,gag,基因编码病毒的核心蛋白；,pol,基因编码病毒复制所需要的酶类（逆转录酶、整合酶和蛋白酶）；,env,基因所编码病毒包膜蛋白，是,HIV,免疫学诊断的主要检测抗原。,调控基因编码辅助蛋白，调节病毒蛋白合成和复制。,（二）分子诊断方法,抗体的检测：酶联免疫吸附法（,ELISA,）和免疫荧光检测法（,IFA,）；感染,2,周后才能逐渐产生病毒抗体；,抗原的检测：酶联免疫吸附法（,ELISA,）检测,P24,抗原，灵敏度低,1.,病毒载量检测,感染者体内,HIV,的定量检测，对病情判断和治疗效果检测极有价值。,目前常用三种技术：,RT-PCR,最低检测限,50,拷贝,/ml,bDNA,最低价测限,50,拷贝,/ml,NASBA,最低检测限,20,拷贝,/ml,PCR,RNA,逆转录,cDNA,整合到宿主基因组中复制，以被感染细胞,DNA,为模板,PCR,扩增；,HIV,为高变异病毒，不同患者体内分离的病毒基因结构有差异，引物设计应根据各编码区的保守序列设计；,灵敏度高，特别是用于无症状,HIV,感染者。,扩增位置 引物序列 扩增片断（,bp),gag,基因,5,-GAACTTTAAATGCATGGGTAAA-3,342,5,-CCAGTAGGAGAAATCTATAAAA-3,gap,基因,5,-ATAATCCACCTATCCCAGATAGGAGAAATC-3,115,5,-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATCC-3,pol,基因,5,-TAGAATTCCTCAGATCACTCTT-3,360,5,-GCAAGCTTATGGGCCATCCATTCC-3,2.,病毒表型和耐药检测,HIV,表型,主要依据逆转录酶和蛋白酶基因突变的检测,最常用的耐药检测方法是基因型检测方法,即查找与病毒耐药有关的基因突变。检测病毒逆转录酶（,RT,）和蛋白酶（,PI,）基因的序列，然后把这些结果与已知的没有发生突变的,HIV,（称为野生株）基因序列进行比较，与之不同的基因序列就认为发生了突变。检测出的任何突变都有可能导致形成,HIV,耐药性，但具体结果的解释必须要有非常有经验的专家和医师来进行。,（三）临床意义,1.,原位杂交：可以显示病毒感染的部位；,2.PCR,：可对无症状的感染者进行早期诊断；,3.,病毒载量检测：在临床进展情况的判定及疗效观察上极有价值。,第九章：细菌感染的分子生物学检验,概述,正常菌群：存在于人体表及与外界相通部位的细菌；,条件致病菌：正常菌群与人体平衡破坏，引起疾病的一类细菌；,病原菌：具有毒性和侵袭力的细菌，造成人体感染；,病原菌的诊断方法：, 直接涂片法, 生化试验, 血清学试验, 分离培养, 动物实验, 分子生物学：灵敏、特异，可进行早期诊断、分型、耐药性检测；,不能确诊或进行分型、耐药性的检测，或费时等,全世界,1/5,人口感染，每年约,300,万死于结核，中国占,70%,，免疫低下个体特别是,HIV,感染者更易于感染结核分枝杆菌。,结核分枝杆菌为革兰氏阳性菌，,细长略带弯曲，,分枝状，,有荚膜，抗酸染色阳性，对多种抗生素有抵抗力。,一,.,结核分枝杆菌,形 态,(,一,),基因组结构,1.TB H37Rv,株基因组是环状双链,DNA,， 共有,4 411 529bp;,2.,共有,4033,基因，功能已知的有,1734,个, 1694,个可能为新基因,;,3.,基因组中有许多药物抗性因子的编码序列，包括水解酶或者药物修饰酶。,（二）分子诊断方法,普通,PCR,、,FQ-PCR,、竞争性,PCR,、免疫杂交,PCR,扩增靶序列：,65KDa,抗原基因（细菌细胞壁上蛋白）,MPB,蛋白基因（结核杆菌复合群特有）,rRNA,基因 （种属鉴定）,ISDNA6110,插入序列,靶序列 引物序列 扩增片断（,bp,）,IS6110,插入,5,-CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG-3,317,5,-TCAGCCGCGTCCACGCCGCCA-3,16SrRNA 5,-GGTGGTTTGTCGCGTTGTTC-3,463,5,-TGCACACAGGCCACAAGGGA-3,DNA,重复序列,5,-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3,245,5,-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3,TB,耐药检测,利福平耐药,-RNA,聚合酶,rpoB,基因,异烟肼耐药,-,katG,基因,链霉素耐药,-S12,的,rpsL,基因,16SrRNA,的,rrs,基因,喹诺酮的耐药,-DNA,解旋酶的,gyrA,和,gyrB,基因,水解酶或药物修饰酶,（,-,内酰胺酶、氨基糖苷乙酰基转移酶和药物外排系统等）,细菌耐药基因的检测,细菌耐药性的产生导致治疗失败、感染复发、增加昂贵抗生素的使用。,机理：由于细菌基因组的变异，导致,1.,细菌细胞外膜通透性改变；,2.,产生灭活酶和钝化酶，如,-,内酰胺酶；,3.,药物作用靶位改变；,4.,代谢途径改变；,（三）临床意义,1.,准确、快速、早期诊断,TB,2.,区分,TB,与其它分枝杆菌,3.,疫情监控和抗痨治疗疗效的评价,二、 淋球菌,淋球菌是淋病的病原菌，人是淋球菌的唯一自然宿主。淋病在我国性传播疾病种中，发病率居首位。淋球菌耐药菌株的出现和流行对淋病的控制带来很大困难。,传播途径：,1.,直接性接触感染,2.,间接接触感染,（一）基因组结构,1.,染色体分子量,980M,，可编码约,5000,个基因，,GC,含量为,50%,；,2.,无操纵子结构,3.,含有,1,至数个,质粒,（,2.6MDa,，,24.5MDa,），通过质粒介导耐药性在不同菌株间的转移；,（二）分子诊断,1.PCR:,扩增的靶序列：编码外膜蛋白,的结构基因，或,16SrRNA,基因、,CPPB,基因（同时存在于染色体及质粒上）,靶序列 引物序列 扩增片断（,bp,）,CPPB,基因,5,-GTTTGGCTGGTTGATTCAAG-3,633,5,-GCAAGATTTCCGATTTGGCG-3,外膜蛋白,5,-TAAAGCAAGCCAAGGTCGCG-3,494,5,-TTTTCACATCTACGCGGCGG-3,5,-CCGAAGCTCAAGACAACCTC-3,181,2.LCR,（,Ligase chain reaction,）,连接酶链反应,(Ligase chain reaction,，,LCR),，是一种新的,DNA,体外扩增和检测技术，主要用于点突变的研究及靶基因的扩增,.,原理：在,PCR,反应体系中加入二对引物，加热,(94,95),使,DNA,变性，双链打开，然后降温退火,(65),，引物与模板,DNA,结合并留下一缺口，如果引物与模板完全互补，,DNA,连接酶即连接封闭缺口，,PCR,反应接着进行，扩增出大量的目标,DNA.,若有点突变，引物不能与模板精确结合，缺口附近核苷酸的空间结构发生变化，连接酶不能封闭缺口，,PCR,反应不能进行，无扩增产物生成，据此可判断模板,DNA,中有无突变,.,（三）临床意义,1.,分子诊断技术具有灵敏性高、快速、特异性好的优点，可检测极微量的淋球菌。,2.,应用于以下几方面：,对菌株进行分型和耐药性分析。,抗生素治疗效果的观察。,进行流行病学分析。,对疑似病例的诊断和鉴别诊断。,衣原体的基因检测,衣原体是介于立克次氏体与病毒之间，能通过细菌滤器，专性活细胞内寄生的一类原核生物。,沙眼衣原体是一种在人体内长期生存并又广泛传播的病原体，常导致人泌尿生殖道疾病及眼病，有,15,种血清型。,一、基因组,沙眼衣原体（血清型,D,）基因组大小,1042Kbp,，,GC,含量为,41.3%,，另有一个,7493bp,的质粒，整个基因组有,894,个蛋白编码基因，其中,604,个,(68%),编码蛋白的功能已明确，,35,个,(4%),编码基因在,GenBank,收录的其他细菌中有同源序列，但功能不清，剩下的,255,个,(28%),在,GenBank,中没有检索到同源序列。,二、分子诊断,1. PCR,扩增靶序列主要有外膜蛋白,(MOMP),基因、特有质粒,DNA,和,rRNA,基因序列。,rRNA,基因,5,-GAAGGCGGATAATACCCGCTG-3,5,-GATGGGGTTGAGCCATCC-3,MOMP,基因,5,-GATAGCGAGCACAAAGACTAA-3,5,-CCATAGTAACCCATACGCATGCTG-3,2. LCR,LCR,的扩增效率与,PCR,相当，其产物的检测也较方便灵敏,三、临床意义,沙眼衣原体感染常缺乏特异症状，易形成隐匿感染，分子诊断技术敏感性和特异性高，适用于早期诊断和无症状携带者的检查；,支原体的基因检测,肺炎支原体,(mycoplasma pulmonis, MP),是原发性非典型肺炎的病原体。,一、基因组结构,肺炎支原体,M129,株基因组有,816394bp,，,G+C,含量为,40%,，含,677,个开放阅读框，,39,个,RNA,编码基因。,二、分子诊断方法,1.PCR,扩增靶序列常选在,16S rRNA,基因组可变区与保守区、特异的染色体,DNA,片段、,P1,蛋白基因区。,2.,核酸杂交,特异的,寡核苷酸探针与样品,DNA,进行斑点杂交，特异性好，但灵敏度不如,PCR,法。,三、临床意义,因肺炎支原体与其他支原体存在共同抗原，免疫学方法检测可出现假阳性和假阴性。,PCR,方法简便快速、特异、敏感， 适于早期快速检测,MP,。,螺旋体的基因检测,梅毒螺旋体,(syphilis spirochete),是人类梅毒的病原体。,一、基因组结构,基因组大小约,1000kb,，为最小的原核基因组之一，,GC,含量为,52.8%,，共有,1041,个开放阅读框，占整个基因组的,92.9%,，每个,ORF,的平均大小为,1023bp,。,二、分子诊断方法,1. PCR,扩增的靶序列有,tpp47,、,bmp,、,tpf1,、,tyf1,、,tmpA,等基因。,2,.,核酸杂交,用同位素或非同位素,(,如生物素、地高辛,),标记的探针与待测标本的,DNA,或扩增后的,DNA,进行斑点杂交。,