实时荧光定量PCR技术详解和总结

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,|Life Technologies Proprietary&Confidential|,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实时定量,PCR,技术,目录,实时定量,PCR,基本原理,实时定量,PCR,实验材料,实时定量,PCR,实验方法,实时定量,PCR,实验结果,实时定量,PCR,基本原理,实时定量,PCR,的定义,实时定量,PCR,标准曲线,定量,PCR,技术：利用,荧光信号的变化实时检测,PCR,扩增反应中,每一个循环扩增产物量的变化,，最终精确的对,起始模板,的定量分析,实时定量,PCR,的定义,定量,PCR,三个基本概念,扩增曲线,指数增长期,平台期,线性增长期,背景期,阈值与,C(t),值,阈值：,是循环开始,3,15,个循环的荧光信号的标准偏差的,10,倍，设定在,扩增曲线,指数增长期,C(t),值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的,扩增循环次数,Threshold line,C(t)value,C(t)value,18.12+/,-,0.04,Threshold line,C(t)value,C(t)value,18.12+/,-,0.04,C(t)value,18.12+/,-,0.04,C(t)value,18.12+/,-,0.04,定量,PCR,的数学原理,理想的,PCR,反应：,X,n,=X,0,2,n,非理想的,PCR,反应：,X,n,=X,0,(1+Ex),n,方程式两边同时取对数得,:,log X,n,=log(X,0,(1+Ex),n,),整理方程式得,:,log X,0,=(-log(1+Ex)n+log X,n,将,C(t),和达到,C(t),值时终产物的量,Xc(t),带入上式得：,log X,0,=(-log(1+Ex),C(t)+log,Xc(t),初始浓度的对数与循环数呈线性关系,n,：扩增反应的循环次数,X,n,：第,n,次循环后的产物量,X,0,：初始模板量,Ex,：扩增效率,荧光强度,-,循环数曲线,初始模板量对数,-C(T),循环数标准曲线,10,4,10,3,10,6,10,5,10,2,10,初始模板量越多，,C(t),值越小,C(t),与初始模板浓度的对数值成线性关系,实时定量,PCR,标准曲线,定量原理,浓度的对数值,与,循环数,呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数（,Ct,值）就可分析样品中起始模板量,定量,PCR,的实验步骤,标准菌株,DNA,的提取,QPCR,探针和引物的设计,阳性克隆质粒的构建,荧光定量,PCR,反应,定量标准曲线,重复性实验,灵敏性实验,实验材料,