植物原生质体培养与体细胞杂交

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 植物原生质体培养与体细胞杂交,第一节 原生质体的分离和纯化,第二节 原生质体培养,第二节 植物体细胞杂交,一、植物原生质体的概念,二、原生质体的分离,三、原生质体的纯化,四、原生质体的活力测定,五、影响原生质体数量和活力的因素,第一节 原生质体的分离和纯化,一、植物原生质体的概念,1880,年，,Hanstein,：,质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质。,原生质体,(protoplast),：去掉细胞壁的细胞或是由质膜包裹的具有生活力的裸露细胞。,亚原生质体,(,subprotoplast,),：,在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体，它可以具有细胞核或没有细胞核。,核质体,(,nuclearplast,),：,由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。,胞质体,（,cytoplast,）,：,不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。,二、原生质体的分离,1.,机械法,2.,酶解法,1.,机械法分离原生质体,借助利器（如刀等）或机械磨损等措施使细胞壁破损，促使原生质体释放的方法。,机械法分离原生质体的主要特点：,产量低；,高度液泡化的贮藏组织；,排除外加酶的有害影响。,2.,酶解法分离原生质体,借助酶解液的作用降解细胞壁，获得大量有活力的原生质体的方法。,主要特点：,（,1,）产量高，适用范围广； （,2,）对活细胞的损伤较轻； （,3,）原生质体可能会受到酶的某些不利影响。,（,1,）材料选择,选择依据：,具有良好的形态发生潜力；,量大、质地均一；,经酶解后原生质体稳定性好、活性高。,常用材料：,幼叶、胚轴、子叶、茎、叶；,愈伤组织、胚状体和悬浮细胞。,（,2,）材料预处理,目的：,改变细胞和细胞壁的生理状态，提高酶解效率，提高原生质体的活力和分裂频率。,方法：,低温处理、 暗处理、 预培养等。,（,3,）酶解,分离原生质体的酶类,纤维素酶,半纤维素酶,果胶酶,胼胝质酶,蜗牛酶,纤维素酶：,从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂。作用是降解纤维素，得到裸露的原生质体 。,如：,Cellulase,Onozuka,R-10,（,Japan,）,Cellulase,Onozuka,RS,（,Japan,）,Cellulysin,（,USA,）,纤维素酶,EA-867,（上海植生所）,果胶酶,/,离析酶：,是从根霉或曲霉中提取出来的，,使细胞间的果胶质降解，,把细胞从植物组织中单独释放出来。,如：,Macerozyme,R-10,（,Japan,）,Pectinase,（,USA,）,Pectolyase,Y-23,（,Japan,）,半纤维素酶：,主要由曲霉中提取，专门分解,半纤维素,。从愈伤组织分离原生质体时，有时增加半纤维素酶。,如：,Rhozyme,HP-150,（,USA,）、,Hemicellulase,（,USA,）,胼胝质酶：,主要用于分离,花粉小孢子,的原生质体。,蜗牛酶：,从蜗牛胃液中分离的酶的粗制剂，含多种解离酶，对孢粉素、木质素有一定的分解能力，用于,分离花粉母细胞,、,四分体细胞,或从,较老的组织,分离原生质体。,崩溃酶：,是一种粗制酶，同时具有纤维素酶和果胶酶等多种酶的活性，在与果胶酶混合使用时，对分离,培养细胞及根尖细胞,有加速解离的效果。,酶溶剂及其渗透压,酶溶剂,：原生质体培养基,渗透压调节剂,：,作用：,代替细胞壁对原生质体起保护作用。,糖醇类,：甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。,使用浓度：,0.2,0.8mol/L,质膜稳定剂：,溶液中加入一些,盐类,，可以保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力。,常用的有：,CaCl2,（,0.7,1.0mol/L,）、,KH2PO4,、,KCl,、,MgSO47H2O,、,MES,（,2-,氮吗啉乙烷磺酸）和葡聚糖硫酸钾等。,酶液的配制,：,按已确定使用的酶和稳定剂的量称取酶和各种稳定剂,并把它们逐步溶解，配制成酶液之后，酶液用孔径为,0.45m,的微孔滤膜,过滤灭菌,后备用。,酶液的,pH,值：,分离原生质体时一般将酶液的,pH,调节在,5,6,之间。,酶液的配制及,pH,值,酶浓度和酶解时间,酶浓度：,纤维素酶：一般为,0.5,5,果胶酶：一般为,0.1,1,蜗牛酶和胼胝质酶：一般为,0.5,2.0,酶解时间：,30min,20h,，,一般,24,小时。,温度：,一般在,25-28,，,兼顾原生质体及酶活性。,酶解过程,：一般是在,黑暗、静止,条件下进行。,酶量：,材料和酶量的比例一般为,1g,：,10ml,。,一些作物所用的酶解液,材料,CaCl2H2O,(mg/L),KH2PO4,(mg/L),MES,(mg/L),纤维素酶,%,果胶酶,%,离析酶,%,半纤维素酶,%,甘露醇,（,mol/L,）,pH,小麦悬浮细胞,1470,95,600,RS 2.0,Y-23 0.2,0.55,5.6,水稻悬浮细胞,1470,95,600,R-10 0.1,、,RS 0.5,Y-23 0.1,1.0,0.40,5.6,玉米悬浮细胞,1470,95,600,RS 3.0,Y-23 0.1,0.5,0.5,0.50,5.6,两步法,：先用果胶酶离析植物组织后收集植物细胞，洗涤后用纤维素酶解离细胞壁。,一步法,：把一定量纤维素酶和果胶酶组成混合酶液,对材料进行一次性处理。,酶解方法,三、原生质体的纯化,纯化的含义：,一是从酶混合液中收集到的原生质体,在培养前必须把,酶液冲洗干净,；二是,得到纯净的原生质体,。,纯化原生质体的方法,1.,飘浮法,2.,沉淀法,3.,界面法,1.,飘浮法,原理：,利用原生质体和其他组分密度的不同，酶解处理中使用,相对分子质量较大,的物质（蔗糖、葡聚糖），离心后使原生质体漂浮在溶液表面，细胞碎片等杂质下沉到管底的方法。,特点：,操作简单，但数量上损失较多。,2.,沉淀法,原理：,酶解处理中使用,相对分子质量较小,的物质（甘露醇），,原生质体的比重大于溶液时,，,在低速下离心后原生质体沉到管底,其余细胞碎片等物多数漂浮在溶液中。,特点：,简单方便，,丢失少，,但纯度不够高。,3.,界面法（梯度离心法）,原理：,选,两种不同渗透浓度的溶液,，,其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，,经离心后使完整无损的原生质体处于,两种溶液,的界面之间,，而细胞碎片等杂质沉于管底，高度净化完整原生质体可在这两相系统的界面上收集到。,特点：,可以收集大量、纯净的原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互积压而破碎。,常用系统,：,PEG,（,6000,）,-,Ficoll,（,400000,）系统，,甘露醇（,182.17,）,-,Ficoll,系统，,蔗糖（,342.3,）,-,甘露醇系统等。,25%,蔗糖溶液,13%,甘露醇溶液,纯化后的原生质体,四、原生质体的活力测定,原生质体活力,有活力原生质体数,观察原生质体数,100,1.,形态识别,：,形态完整，富含细胞质，颜色新鲜，正常球形 。,2.,相差显微镜观察法,：,观察细胞质环流、核的正常与否。,3.,酚藏花红染色法（,0.1%),：,有活力原生质体不被染色，而无活力的被染成红色 。,4.,伊凡蓝染色法,(0.025%),：,活力受损或死细胞才能摄取这种染料，活细胞不摄取。,5.,荧光素双醋酸酯染色法（,0.01%,）：,即,FDA,法，,FDA,能自由穿越完整细胞质膜，一旦进入原生质体后受酯酶裂解形成有极性的物质,荧光素，在紫外光照射下产生绿色荧光。,造粉体,五、影响原生质体数量和活力的因素,植物材料的类型及生理状态,酶的种类、浓度、组合及酶解时间、酶解方式等,渗透压稳定剂,质膜稳定剂,温度、光照及,pH,第二节 原生质体培养,一、,原生质体培养的意义,1.,建立单细胞无性系,2.,为细胞融合奠定基础,3.,遗传工程的理想受体,4.,原生质体是多种基础理论研究的实验系统,1.,培养基,（,1,）渗透压：,与细胞渗透压,等渗,或,稍,低,。,渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖、麦芽糖和葡萄糖等。,当原生质体再生细胞壁并开始分裂后,必须,逐步降低渗透压,直到与细胞培养基同样的水平。,二、原生质体培养,（,2,）无机盐,:,大量元素：一般较愈伤组织培养中的浓度低,NO3- / NH4+,的比例高,Ca+,、,Mg+,需求高,（,3,）有机成分,：,种类齐全,（,4,）激素,：,生长素与细胞分裂素对诱导细胞壁的形成和细胞分裂、分化是必需的。,（,5,）,pH,值及灭菌：,一般,pH,值以,5.6-6.0,为宜，过滤灭菌。,2.,原生质体培养方法,饲养层培养,方法一,：,X-,射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入,0.6%,琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。,方法二,：,X-,射线杀死原生质体，与,0.6%,琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与,0.6%,琼脂混合，培养于饲养层上。,3.,培养条件,光照,：,新分离处理来的原生质体应在散射光下或黑暗中培养。,温度,：,一般,25,30,。,湿度：,100%,。,4,、原生质体发育和植株再生,第一次分裂,再生细胞壁,荧光增白剂（卡氏白,),圆变为,椭圆形,第二次分裂,第,N,次分裂,小,细胞团,肉眼可见的细胞团,愈伤,组织,植株再生,23,周，植板率,10h,以上,诱导器官发生,诱导形成胚状体,5.,原生质体培养过程中的管理,及时,添加,新鲜培养基,逐步,降低,培养基的渗透压,及时,调整,培养基中的激素成份,烟草叶肉原生质体培养中液体培养中渗透压的改变步骤,原生质体培养在,8ml,内含,9%,甘露醇,的培养基中,2,周,加入,2ml,内含,6%,甘露醇,的培养基,2,周,加入,2ml,内含,3%,甘露醇,的培养基,2,周,加入,2ml,无甘露醇,的培养基,2,周,将形成的较大的,细胞团,或,愈伤组织,转移到,固体,培养基,(,内含,2.0mg/L IAA,和,1mg/L 6-BA),上培养促进芽的形成,2,周,转移到,MS,基本培养基上促进苗产生根,最后长成完整植株,例：,四、影响原生质体培养的主要因素,1,、,原生质体的活力,2,、,原生质体的起始密度,3,、,原生质体的营养和环境,4,、,基因型,1.,原生质体的活力,细胞壁降解酶的种类和组合,渗透压稳定剂,质膜稳定剂,温度因子的影响,植物材料的类型及生理状态,密度过,高,时，有可能造成培养物营养不足或细胞代谢产物过多而妨碍再生细胞的正常生长,密度过,低,时，再生细胞不能进行持续分裂,一般原生质体培养时，,起始密度,为,10,4,-10,5,个,/ml,，,低密度下,的培养使用较复杂的培养基和特殊的培养方法。,2.,原生质体的起始密度,3.,原生质体的营养和环境条件,光照：原生质体分裂诱导不需要光，,暗培养,温度：,25,30,湿度：,100,培 养 基,环境条件,硝酸盐和铵盐比例,高,与原生质体质膜稳定有利的物质,用量比较,高,。如,CaCl,2,、,KH,2,PO,4,渗透压的特点：,含有,高,浓度的甘露醇，或以葡萄糖和蔗糖代替甘露醇。,应根据原生质体再生细胞的发育状态和需要,调节,各发育时期的营养和碳源的成份。,4.,基因型,植物形态发生受基因控制的，是一个复杂的过程，不同基因型的原生质体的形态发生能力不同。而且原生质体的不同生长发育时期受不同基因所控制。,第三节、植物体细胞杂交,一、植物体细胞杂交的意义,二、原生质体诱导融合的方法和融合类型,三、杂种细胞的选择系统,四、体细胞杂种植株的鉴定,五、杂种细胞的发育及其特性,体细胞杂交（,somatic hybridization,）,/,原生质体融合,(protoplast fusion),：,指把两种,不同种,或,不同属,、,不同科,生物的细胞的原生质体分别分离出来,再用一定的技术而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成,杂种细胞,，进一步发育成完整植物体。也称为,细胞融合。,一、体细胞杂交的意义,突破物种间生殖隔离，创造新物种,培育作物新种质和新品种,细胞质杂种的获得,细胞膜和细胞器行为的研究、细胞器的互作研究,染色体行为的研究,1960,年：,酶法分离原生质体,的诞生，打开了利用原生质体作为实验材料的许多重要研究领域。,1970,年：,Power,首次用,硝酸钠,做诱变剂，可使燕麦、玉米等根原生质体有较大量的融合。,1972,年：,Carlson,等获得第一个,种间,植物细胞杂种（粉蓝烟草和郎氏烟草）。,1974,年：,Kao,等建立了,聚乙二醇（,PEG,）,诱导植物细胞融合的技术。,1978,年：,Melcher,等获得了第一个,属间,细胞杂种（番茄,+,和马铃薯）。,1981,年：,Zimmerman,等发明了,电融合仪,，并首次提出了,电融合,概念。,1990,年：来源于体细胞杂交的第一个商品化的烟草栽培品种释放。,1995,年：获得第一个烟草,-,老鼠杂种植物。,目前：,很多研究都集中在一些细胞组织培养技术已比较成熟的植物种属,如,烟草属,茄属,等中,主要研究方面是在种间杂种中,转移个别染色体,或,基因,，或通过胞质杂种获得,中间材料,以供育种应用。,自发融合（,spontaneous fusion,）,：,去壁后的,同种,原生质体之间常发生融合形成,同核体（,homokaryon,）,，频率一般在,8,30%,之间。它是由于不同细胞间胞间连四的扩展和粘联造成的，不属于细胞杂交的范畴。,诱导融合（,induced fusion,）,：,通过人工诱导的方式，使,不同来源,的原生质体之间发生融合，形成,异核体（,heterokaryon,）,。,二、原生质体诱导融合的方法和类型,诱导融合,对称融合,非对称融合,融合产物,同核体,异核体,细胞质杂种,同核体：,基因型相同的细胞融合成的杂交细胞。,异核体：,基因型不同的细胞融合成的杂交细胞。,细胞质杂种：,只含有亲本一方的核基因组，而含有亲本双方的细胞质基因的细胞杂种。,杂种细胞：,由不同来源的原生质体经诱导,融合后形成的细胞,。,细胞杂种：,由不同来源的原生质体融合形成的杂种细胞经培养后再生出的,杂种植株,。,（一）、诱导原生质体融合的方法,1,、化学融合,（,1,）,NaNO3,融合,（,2,）高,Ca2+,和高,PH,值诱导融合,（,3,）,PEG,（聚乙二醇）诱导融合,（,4,）,PEG-,高,Ca2+,和高,PH,值诱导融合,2,、物理融合：电融合,1.,化学融合,（,1,）,NaNO3,融合：融合率,0.1,4,方法：,5.5,NaNO3 + 10,蔗糖，在,35 5min -,离心,-30 30min,，清洗培养。,机理,：,Na,等离子能中和原生质体表面的负电荷，使凝聚的原生质体质膜紧密接触，促进细胞融合。,特点,：,对原生质体的破坏小，但异核体形成的频率不高，尤其对高度液泡化的叶肉原生质体不易诱发融合。因此目前几乎不再使用。,机理：,高,PH-,高的浓度,Ca2 +,离子能中和质膜正常的表面电荷，可使凝聚的原生质膜紧密接触，一定的高温可促进膜的融合。,特点：,融合产量高，但,高,pH,值对细胞有毒害作用。,（,2,）高,Ca2 +,和高,PH,值诱导融合,：融合率,10,（,3,）,PEG,（聚乙二醇）诱导融合,1974,年：,Kao,和,Michayluk,采用此法大大提高了异核体的融合频率，重复性强。,方法：,将原生质体混合液用,28,58,的,PEG,（相对分子质量,1500,6000,）溶液处理,15,30min,，清洗后培养。,特点：,双核异核体形成频率高，重复性好，,PEG,诱导无物种特异性。,（,4,）,PEG-,高,pH-,高,Ga2+,诱导融合,1976,年：,Kao,发现用高,pH,和高,Ca,结合,PEG,融合频率更高。用高钙强碱溶液代替培养基清洗,PEG,。,PEG,和高,Ca+,、高,PH,值对融合起到了,协同,作用，,PEG,直接或间接通过,Ca+,起作用。,诱导率：,40,50,以上。,PEG,的作用机理：,PEG,分子具有轻微的,负极性,，可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成,H,键，从而在原生质体之间形成,分子桥,，其结果使,原生质体发生粘连,。,在洗脱过程中，,PEG,将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。,优点,：,融合,成本低,，勿需特殊设备；,异核率较高，,可重复性强,；,PEG,诱导的融合过程,不受物种限制；,毒性低。,缺点：,融合过程繁琐；,一些植物种原生质体质膜性质强弱不一,常出现对,PEG,敏感,而破碎的现象；,PEG,的分子量大小,浓度高低的使用不当也可影响融合的效果。,PEG,诱导融合的特点,化学融合的过程,：,聚集阶段，原生质体膜彼此靠近；,局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，在,2,个原生质体间细胞质呈连续状态；,细胞质扩散，融合完成，形成异核体。,融 合 过 程,电融合：,指利用改变电场来诱导原生质体彼此连接成串，再施以瞬间强脉冲使质膜发生,可逆性电击穿,，促使原生质体融合的方法。,2,电融合法,（,1,）电融原理：,当原生质体处于,电导率很低,的溶液中时，通电后电流即通过原生质体，在非均匀的,交变电场,中时，发生双向电泳而进入电场反应强的区域，同时，原生质体在电场作用下，发生极化而产生偶极子，使原生质体沿电场线运动，细胞紧密接触,排列成串,；然后给予短暂的,高压脉冲,，导致接触面的细胞膜,击穿,，随后紧密接触的细胞膜发生,结合,，导致细胞融合。,为了稳定这个过程，在短期内需要施加交流电压。,加上脉冲电流使原生质体局部破裂后融合，形成杂种细胞,（,2,）电融合的优点,：,不存在对原生质体的毒害问题；,融合效率高，重复性好，融合率达,60,以上；,融合技术操作简便，对融合原生质体数易于控制等。,影响原生质体融合的因素,植物原生质体融合,无种属特异性,，其融合效率仅与,外界条件,有关，而与其自身种属无关。,原生质体质量、密度,融合方法,PEG,的规格和纯度、作用时间,电融合参数,融合液：,少量,CaCl2,，既可维持一定电导率，又对细胞有保护作用,根据,融合时细胞的完整程度,，可分为以下两种融合类型：,1.,对称融合（,symmetric fusion,）,2.,非对称融合（,asymmetric fusion,）,（二）原生质体融合的类型,1.,对称融合,（,symmetric fusion,）：,即,两个完整,的细胞原生质体融合，父母本均未处理，对后代贡献一样。 对称融合常会产生,对称杂种,或,不对称杂种。,（,2,）非对称融合,（,asymmetric fusion,）：,一方亲本的,全部原生质体,与另一亲本的,部分核物质及胞质物质,重组，形成,不对称杂种,。,利用物理或化学方法使某,亲本的核或细胞质失活,后再进行融合。,核失活方法：射线，碘乙酰胺（,IOA,），碘乙酸,质失活方法：罗丹明（,R-6-G,）,非对称融合中,依父母本在后代中贡献不同，它可以分为几种：,A,完整细胞,+B,细胞核,A,完整细胞,+B,细胞质,A,完整细胞,+B,细胞质和部分核物质,A,细胞核,+B,细胞质,（三）细胞质杂种（,cybrid,）,细胞质杂种：,指具有一个亲本的核，而细胞质为杂合或另一亲本的体细胞杂种。,由以下途径产生,：,对称融合：,融合后的某一阶段一个亲本的核或染色体被排除。,不对称融合：,使一个亲本的核失活或去核。,细胞质杂种的意义,：为核外遗传物质交流重组及研究核质互作提供了机会。,三、杂种细胞的选择系统,1.,细胞系,互补选择法,2.,物理特性差异选择,法,3.,生长特性差异选择,法,1.,细胞系,互补选择法,利用两个亲本具有不同的,遗传和生理,特性，在特定培养条件下，只有,发生互补作用,的杂种细胞才能生长的选择方法。,激素自养型互补选择,叶绿素缺失突变体互补选择,营养缺陷型互补选择,抗性突变体互补选择,2.,物理特性差异选择法,利用原生质体的物理特性，如大小、颜色、漂浮密度等的差异，将融合细胞筛选出来的方法。,可见标记选择法：,利用融合细胞具有的,可见标记,，在倒置显微镜下，用微管将融合的细胞吸取出来进行选择的方法。,天然颜色标记分离,荧光素标记法,流式细胞仪分选,离心法：,不同的融合产物漂浮密度的差异，利用不同的沉降速度分离融合产物。,3.,生长特性差异选择法,：,依据植物细胞的,再生能力,、对培养基成分和培养条件的,要求与反应,不同、或,愈伤组织的形态,等进行选择杂种细胞。,四、体细胞杂种植株的鉴定,杂种植株的鉴定方法：,形态鉴定,细胞学鉴定,生化鉴定,分子标记鉴定,基于基因组,DNA,变异的多态性,直接反映基因组,DNA,间的差异,柿树,D. kaki,cv,.,Jiro,D.,glandulosa,甘蓝型油菜,野生型油菜,形态鉴定,18,条染色体,36,条染色体,细胞学鉴定,生化鉴定,分子标记鉴定,细胞杂种,细胞分裂与染色体数目的不稳定性,基因转移与性状表达,遗传上的不稳定性,核质重组细胞器重组部分核物质或细胞器丢失核分裂的非同步性,体细胞融合,五、细胞杂种的发育及其特性,1.,原生质体、亚原生质体、核质体、胞质体的概念。,2.,原生质体培养的方法。,3.,为什么原生质体要培养在等渗培养基中？培养过程中如何管理？,4.,影响原生质体培养的主要因素有哪些？,5.,细胞融合有哪几类？,6.,简述,PEG,融合与电融合的原理及各自特点。,7.,原生质体融合的基本过程是什么？,8.,杂种细胞的选择方法有哪些？,9.,体细胞杂种的鉴定方法有哪些？,10.,什么是细胞质杂种？胞质杂种有什么作用？,思 考 题,