第二章 沉淀法PPT课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 沉淀法,沉淀法（溶解度法）,是纯化生物大分子物质常用的一种经典方法优点：操作简单，成本低廉分类：盐析沉淀 有机溶剂沉淀 选择性沉淀,第一节 基本原理,原理：,根据各种物质的结构差异性（如蛋白质分子表面疏水性基团和亲水基团之间的差异性）来改变溶液的某些性质（如,pH,、极性、离子强度、金属离子等），进而导致有效成分的溶解度发生变化。,一、盐析法,原理：是蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。,原因：盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。,第二节 沉淀的类型与操作,一般操作步骤（蛋白质分级沉淀时常用）,1,）选择一定浓度范围的盐溶液（如,0-25,饱和度硫酸铵），使部分杂质呈,“,盐析,”,（沉淀）状态，有效成分呈,“,盐溶,”,（,溶解,）,状态。,2),经离心后得到上清液，再选择一定浓度范围的盐溶液,（,如,25,-60,饱和度的盐溶液,）,，使有效成分等物质呈盐析状态，而另一部分杂质呈盐溶状态，用离心法收集的沉淀物即为初步纯化的有效成分物质。,1.,盐的分级沉淀,（,1,）盐类的选择 常选用：硫酸铵优点：,a.,溶解度大，对温度不敏感，当水温,25,时，硫酸铵的饱和溶解度（即每升溶剂可溶解盐的克数）为,769,克。当水的温为,0,时，其饱和溶解度,679,克。,b.,分级效果好，有些抽提液经过加入适量硫酸铵的一次性可除杂蛋白,75%,以上,c.,有稳定蛋白质结构的作用，将,2-3mol/L,硫酸铵盐析的蛋白质置低温下保存一年，其性质没有变化,d.,价格低廉，废液可肥田缺点：即得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐,（,2,）硫酸铵盐析的操作,固体加入法：在溶液中逐步加入固体硫酸铵，加到一定饱和度时，蛋白质可沉淀出来。注意：控制加入的速度，在搅拌下、以少量多次方式缓慢地加入，待先加的硫酸铵溶解后再加入少量的硫酸铵。,饱和溶液加入法,是使蛋白质脱水沉淀比较温和的方法,蛋白质溶液中逐步加入预先调好,pH,的饱和硫酸铵溶液，不同饱和度所需的硫酸铵量可用计算：,V,需加入硫酸铵溶液的体积（毫升）；,V,0,原来溶剂的体积（毫升）；,S,1,原来溶液的百分饱和度；,S,2,要求达到的百分饱和度；,S,3,需要加入硫酸铵溶液的饱和度（一般用,100%,的）。,优点：比加入固体硫酸铵沉淀法温和。,缺点：对于大体积样品不适用。因为硫酸铵溶液的大量加入，将导致样品溶液体积增加。,透析盐析法,将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度。特点：盐浓度是以连续的状态变化，可以避免盐浓度局部升高产生的不良影响，分离效果好。缺点：只用于要求较精确、样品体积小的试验。,2,盐析曲线的制作,用盐析法沉淀欲分离样品时所需盐浓度范围要通过实验确定。,具体步骤：,取一定体积已测含量的蛋白质或酶待分离溶液，调节,pH,至稳定范围，分,6-10,次加入不同量的硫酸铵：第一次加硫酸铵到溶液出现微弱混浊状态时，静置一段时间，离心或过滤即得到第一个分级沉淀部分。接着以同样的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中，则得到第二个分级沉淀部分。,如此连续进行，便可得到,6-10,个分级沉淀部分。然后将每个分级沉淀部分分别重新溶解于一定体积的适宜,pH,的缓冲液中，根据其蛋白质或酶含量和相对应的硫酸铵浓度之间的关系作图，即可得到典型盐析曲线。,在此曲线基础上，参照分级试验方法，可找出有利于提高收得率和纯化倍数的精细盐析范围。,3.,盐析的影响因子,（,1,）盐析常数（,K,a,）,蛋白质在溶液中的溶解度和该溶液的盐浓度的关系为：溶解度（,S,，以,mg/ml,表示）的对数值与溶液中盐的浓度（,M,）成反比例关系，可用公式表示：,lgS,-K,a, M,式中,表示有效成分在水中溶解度的对数值；,M,表示克分子浓度；,K,a,表示有效成分在特定条件下的数值，即表示有效成分的溶解度降低的速率是随着盐浓度的增加而增加的。,K,a,值大，则意味着有效成分溶解度降低的速率快。,因此，对一种有效成分而言，,K,a,值越大，分级范围越窄。盐析效果就越好。 某一蛋白质的,K,a,值： 与蛋白质本身的性质有关 与溶液的,pH,、温度和盐的种类等有关,(2),盐的分级范围的差异性,当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋白质的,K,a,值都很大，而且盐析范围（盐离子强度）差异明显，则分离效果好；若,K,a,值很大，但盐析范围差异较小，则分离效果不好。,(3) pH,和盐浓度,溶解度与,pH,和盐浓度有密切关系。当这两种因子变动时，溶解度将发生明显的变化。,选择适当,pH,的盐溶液，可提高对有效成分的盐析效果。,另外，硫酸铵水溶液显酸性，为防止其对某些蛋白质的破坏，应及时用氨水调,pH,至中性或视有效成分的,pH,而定。,(4),蛋白质的纯度和浓度,蛋白质存在的形式和浓度不同，盐析范围和溶解度也不同。,在混合的蛋白质溶液中，不同分子间的相互作用会发生共沉淀现象。蛋白浓度越高，这种现象越明显，盐析分离效果则越差。,因此，一般控制样品液蛋白浓度在,0.2,-2,为宜。,(5),其它,在溶液中加,1mmo1/L,的,EDTA-Na,2,盐，以除去沉淀剂中带入的金属离子。,或控制加硫酸铵沉淀的时间，一般二小时左右。,4,脱盐,常用方法：凝胶过滤法和透析法,具体操作：是把待脱盐溶液装入有一定孔径的透析袋，扎紧袋口（袋内留适当的空间）。漂在水或适当的透析液中。要防止透析液从袋口进入，以免引起透析袋胀裂。,盐离子和小分子物质将穿过半透膜由高向低进行扩散渗透，而蛋白质等则留在袋内。,不断更新透析液，若用温和搅动的办法则效果较好；为了避免蛋白质或酶类破坏，在低温下进行。,透析时注意：,（,1,）透析袋的处理,新的透析袋用蒸馏水洗净，无漏洞时，即可使用。,除去透析袋中所含盐类时，处理方法：,将透析袋置,500,毫升含,1mmo1/L EDTA-Na,2,的,2,碳酸氢钠溶液中煮沸,10,分钟，用干净镊子或戴橡皮手套取出，蒸馏水煮沸、漂洗后，可使用。用过的透析袋同样处理后，能重复使用。 保存：泡在蒸馏水中置低温（,4,）或泡在,70,的乙醇中保存。,（,2,） 选用适当的透析液 一般选用：低离子强度的中性缓冲液对含有辅基的酶透析时，在透析液中宜加入适量的辅基或保护辅基的试剂。为了防止微生物生长，透析应在,4,进行或在透析液中添加,0.02,叠氮化钠。,(3),掌握透析时间,搅拌下进行，样品液与透析液体积之比以,1:10,较好，一般三小时。,在静止状态下过夜进行时，则比例应扩大到,1:20,以上。,盐脱是否彻底，要经常检查：,除去硫酸铵，可用,10%,氯化钡检查,除去氯化钠，可用,10,硝酸银检查,透析液中检测不出现硫酸钡或氯化银沉淀，即透析完成。,二、有机溶剂沉淀法,有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因：（,1,）与盐溶液一样具有脱水作用,（,2,）有机溶剂的介电常数比水小，导致溶剂的极性减小常用的有机溶剂：甲醇、乙醇和丙酮,用有机溶剂沉淀蛋白质，需加入的有机溶剂量，一般以体积为单位计算：,V,需加入有机溶剂的体积,V,0,蛋白溶液的原始体积,S,1,蛋白溶液中有机溶剂的浓度,(,体积百分浓度,),S,2,蛋白溶液中欲达到的溶剂浓度,(,体积百分浓度,),如果使用的有机溶剂含量不是,100,而是,95%,，则公式中的,100,应改,95,，余此类推。,需要指出：,（,1,）低温下操作 由于有机溶剂加入水溶液时产生放热反应会引起蛋白质变性,有机溶剂预冷至,-10,，在低温下进行,（,2,）中性盐的作用,少量的中性盐能增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，降低有机溶剂对蛋白质的变性作用，提高分级效果。若加入过多，可引起蛋白质析出，影响有机溶剂的分级作用。中性盐的离子强度在,0.05,以下时，能防止蛋白质变性。用有机溶剂沉淀蛋白质时，宜在稀盐溶液或低浓度缓冲液中进行。,（,3,）多价阳离子的作用,蛋白质和多价阳离子（如,Zn,2+,和,Cu,2+,等）能结合形成复合物，使蛋白质在有机溶剂中的溶解度降低。这对在高浓度溶剂中才能沉淀的蛋白质特别有益。例如，在某些蛋白质溶液中只要加入,0.005-0.02nmol/L Zn,2+,，就可大大减少有机溶剂的用量，而将蛋白质沉淀出来。,三、 蛋白质沉淀剂,碱性蛋白质,多价阳离子的碱性蛋白质，如鱼精蛋白，除能有效地沉淀核酸类物质外，还能沉淀某些蛋白质。,缺点：,（,1,）反应不可逆，应用受到限制,（,2,）在应用多价阳离子物质时，因其水溶液,pH,值为,2-3,，所以要小心地中和后，再加到蛋白质溶液中,2,凝集素,植物中特殊的蛋白质，对糖蛋白中糖链的末端糖序列具有明显、特异的凝集力。例如，伴刀豆球蛋白与含有葡萄糖、甘露糖等分子的糖蛋白能发生特异的凝集沉淀作用，通过离心操作可把糖蛋白和一般蛋白质分开，获得的凝集素,-,糖蛋白复合物用单糖作抑制剂就能使其解离。优点：反应条件较温和，专一性强,3,重金属,重金属盐如铅盐、汞盐作为蛋白质沉淀剂能使蛋白质或酶纯化。重金属会使蛋白质变性，因此控制在较温和的条件下进行，并要及时通过透析方法把蛋白质和重金属尽快分开。,四、聚乙二醇沉淀作用,水溶性非离子型聚合物，可使蛋白质发生沉淀作用。,沉淀作用较满意的聚合物是分子量在,400-6000,之间的聚乙二醇。,优点：条件温和，不易引起蛋白质变性，沉淀较完全，应用范围广。,缺点：易受各种因子如,pH,、离子强度、蛋白质浓度及聚合物分子量的影响。,五、选择性沉淀法,根据各种蛋白质在不同物理化学因子（如温度、酸碱度和有机溶剂等）作用下稳定性不同的特点，用适当的选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中（或者发生可逆性沉淀），从而达到纯化有效成分的目的。,原理：等电点、热变性、酸碱变性和特殊的可逆沉淀作用,优点：选择性较强，方法简单，种类较多,缺点：应用范围较窄,应用范围：各种生物大分子物质的沉淀,