免疫组织化学技术免疫组织化学方法

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,免疫组织化学,技术,基本原理,通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原 抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。,组织与细胞材料的制备,免疫组织化学方法,组织与细胞材料的制备,组织石蜡切片制作,组织冰冻切片制作,细胞爬片制作,细胞涂片制作,切片的制作,组织的固定,组织石蜡包埋,切片,目的,:,（,1,）,防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞,的固有形态。,（,2,）,使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶,性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的,死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。,（,3,）,使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造,成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。,（,4,）,固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制,片。,（,5,）,防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。,（,6,）,经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便 于辨认。,组织材料的固定,固定液的选择：,(1),甲醛固定液：,10,福尔马林，,10,中性福尔马林，,10,中,性缓冲福尔马林,(2)4,多聚甲醛固定液,(3)Bouin S,液及改良,Bouin S,液,(4)Zenker S,液,(5)Zamboni S,液,(6)PLP,固定液：过碘酸,-,赖氨酸,-,多聚甲醛固定液。该固定剂,较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保,存较好。,(7)PLPD,固定液 取,PLP,固定液,25ml,，加入,2.5%,重铬酸,25ml,。,(8)Kanovsky S,液,(9)Methacarn,固定液，对核内抗原的保存效果较好。,(10)PEG,液,(11)0.4%,对苯醌,(12),碳二亚酰胺,-,戊二醛（,ECG-G,）液,(13),丙酮及醇类固定剂,固定时间：,固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。,大组织：,75,乙醇,30,120min,，,85,乙醇,30,120min,，,95,醇,2h,，,95,乙醇,2h,，,95,乙醇,过夜，无水乙醇,30,60min,，无水乙醇,30,60min,，无水乙醇,60min,120min,，二甲苯,、,和,各,15min,（可视观察结果而定），石蜡,30min,石蜡,1,2h,，石蜡,2,3h,。,小组织：,75,乙醇,30min,，,85,乙醇,30min,，,95,乙醇,1h,、,1h,、,过夜或,2h,，无水乙醇,、,和,各,30min,，二甲苯,15min,、,10min,、,10min,（肉眼观察），石蜡,30min,，石蜡,30min,，石蜡,1,2h,。,组织石蜡包埋,切,片,片,载玻,片,片的,清,清洁,：,：,市售,载,载玻,片,片需,经,经清,洁,洁液,泡,泡,24h,，流水冲洗,，,，系列乙醇,浸,浸泡，凉干,涂,涂胶，如需,开,开展原位杂,交,交，还需将,玻,玻片,240,烤,2h,。,切片粘合剂,的,的使用：,（,1,）多聚赖氨,酸,酸（分子量,300KD,）：,0.5%,浓度。（,2,）,APES,试剂（,3-,氨基、丙基,三,三氧基硅烷,）,）,干净载玻片,丙酮,5min,用镊子夹住,浸,浸入,APES,试剂（,1ml+50ml,丙酮）,1,3,次纯丙酮,洗,洗二次干,燥,燥玻片用,铝,铝箔包好，,室,室温或,4,保存备用。,（,3,）铬矾明胶,液,液：铬矾,0.5g,明胶,5g H,2,O,2,1000ml,（,4,）甲醛明胶,液,液：,40,甲醛,2.5ml,明胶,0.5gH,2,O,2,100ml,切片：,石蜡切片：,(1),连续切片按,序,序贴在玻片,的,的下,1/3,。,(2)52,60,烤片,18h,。,(3),切片厚,2,4,m,。,(4),切片刀要快,(5),编上号,(6),切片可在,4,保存数年,冰冻切片：,(1),冰冻切片分,固,固定和新鲜,组,组织，固定,组,组织需经庶,糖,糖处理,24h,，冰冻切片,。,。,(2),冰冻切片后,需,需凉干后立,即,即固定,(3),冰冻切片固,定,定后,-80,保存备用,细胞爬片制,作,作,将处理好的,盖,盖玻片放入,接,接种了细胞,的,的培养瓶或,六,六孔板内。,待细胞生长,达,达到,60,以上后取,出,出玻片。,用,4%,的多聚甲醛,固,固定,2h,以上。,可加甘油封,存,存置于零下,20,度保存。,细胞涂片制,作,作,离心将细胞,收,收集出来，,用,用预冷的,PBS,洗,2,3,遍，最后用,PBS,将细胞重悬,。,。,吸取,30,50ul,（可根据细,胞,胞量调整）,滴,滴至处理过,的,的载玻片上,，,，然后涂抹,均,均匀。,待稍微风干,以,以后加,4,多聚甲醛,溶,溶液覆盖细,胞,胞，固定,2,4,小时。,在细胞上加,一,一层甘油放,-20,保存。,免疫组织化,学,学方法,荧光标记免,疫,疫组织化学,酶联免疫组,织,织化学,荧光标记免,疫,疫组织化学,直接法,间,间接法,酶联免疫组,织,织化学,ABC,法,S-P,法,免疫组化二,步,步法,二步法,免疫,组化染色步,骤,骤,二甲苯脱蜡,，,，梯度酒精,置,置换二甲苯,PBS,冲洗3次，,每,每次3分钟,根据每一种,抗,抗体的要求,，,，对组织抗,原,原进行相应,的,的修复,0.3%过,氧,氧化氢甲醇,液,液阻断20,分,分钟，以消,除,除内源性过,氧,氧化物酶的,活,活性,PBS,冲洗、浸泡5分钟，3,次,次,正常山羊血,清,清室温封闭10分钟,甩去血清，,加,加入适当稀,释,释的一抗，37孵育60分钟或4过夜,PBS,冲洗，浸泡5分钟，3,次,次,滴加多聚螯,合,合物，37,孵育30,分,分钟,PBS,冲洗，浸泡5分钟，3,次,次,新鲜配置酶,底,底物显色液,DAB,显色310分钟,流水冲洗,苏木素复染,，,，脱水，透,明,明，封片。,显微镜观察,拍,拍照,IPP,软件分析光,密,密度,抗原修复方,法,法,真空负压抗,原,原修复法：,切片脱蜡,至,至水。,0.3%H2O2,甲醇真空负,压,压处理,5,分钟。,自,自来水洗，,蒸,蒸馏水洗。,0.01M,柠檬酸盐缓,冲,冲液（,PH6.0,），真空负,压,压干燥箱预,先,先调至,95,，真空负压,处,处理,10,分钟。,待,待修复注降,至,至室温的一,，,，,PBS,洗,3,次，随后按,选,选好的免疫,组,组化染色方,法,法进行染色,。,。,微波辐射抗,原,原修复法：,切片脱蜡,至,至水。,0.3%H2O2,甲醇处理,10,分钟。,自,自来水洗，,蒸,蒸馏水洗。,0.01M,柠檬酸盐缓,冲,冲液（,PH6.0,），于微波,炉,炉内微波辐,射,射,10,分钟，如检,测,测,Er,和,Pr,则需要,20,辐射分钟左,右,右。待,修,修复液降至,室,室温后，,PBS,洗,3,次，随后按,选,选好的免疫,组,组织化学的,染,染色方法进,行,行染色。,高压抗原修,复,复法：,切片脱蜡,至,至水。,0.3%H2O2,甲醇处理切,片,片,10,分钟。,自,自来水洗，,蒸,蒸馏水洗。,切片放,入,入抗原修复,液,液中，边同,容,容器放入高,压,压锅中加热,至,至沸腾。盖,上,上压力阀至,喷,喷汽后持续,1,4,分钟。,待,待修复液恢,复,复至室温后,，,，,PBS,洗,3,次，随后按,选,选好的免疫,组,组织化学染,色,色方法进行,染,染色。,隔水热抗原,修,修复法：,切片脱蜡,至,至水。,0.3%H2O2,甲醇处理切,片,片,10,分钟。,自,自来水洗，,蒸,蒸馏水洗。,切片放,入,入,0.01M,柠檬酸盐缓,冲,冲液（,PH0.6,）中，边同,容,容器一起放,入,入水溶锅中,加,加热，其间,应,应不断用温,度,度计测其温,度,度，待抗原,修,修复液的温,度,度达到有效,温,温度后（,92,）。即开始,计,计时，持续,40,分钟。,待,待抗原修复,液,液恢复至室,温,温后，,PBS,洗,3,次，随后按,选,选定好的免,疫,疫组化染色,方,方法进行染,色,色。,电炉加热抗,原,原修复法：,切片脱蜡,至,至水。,0.3%H2O2,甲醇处理切,片,片,10,分钟。,自,自来水洗，,蒸,蒸馏水洗。,将切片,放,放入抗原修,复,复液中于电,炉,炉上加热，,不,不时用温度,计,计测量温度,，,，当达,92,后，即可拔,离,离电源，当,温,温度低于,92,时，再插上,电,电源，如此,反,反复持续至,10,分钟左右。,待抗原,修,修复液降至,室,室温后，,PBS,洗,3,次，随后按,选,选定的免疫,组,组化染色方,法,法进行染色,。,。,胃蛋白酶消,化,化法：,切片脱蜡,至,至水。,0.3%H2O2,甲醇处理切,片,片,10,分钟。,自,自来水洗，,蒸,蒸馏水洗。,PBS,洗,3,次，,1,分钟,/,次。滴,上,上配制好或,商,商品化的胃,蛋,蛋白酶，处,理,理切片,20,分钟左右。,PBS,冲洗,3,次，,2,分钟,/,次。后,按,按选择好的,免,免疫组化该,法,法进行染色,。,。,胰蛋白酶消,化,化法：,切片脱蜡,至,至水。,0.3%H2O2,甲醇处,理,理切片,10,分钟。,自,来,来水洗,，,，蒸馏,水,水洗。,PBS,洗,3,次，,1,分钟,/,次。,滴上,自,自配的,或,或商品,化,化的胰,蛋,蛋白酶,，,，处理,切,切片,20,分钟左,右,右。,PBS,洗,3,次，,2,分钟,/,次。,后按,选,选好的,免,免疫组,化,化染色,方,方法进,行,行染色,。,。,注意事,项,项,一、抗,体,体的保,存,存,浓缩抗,体,体：有,效,效期内,，,，只需,放,放在,4,冰,冰箱内,，,，保存,时,时间可,达,达,1-3,年。,即用型,抗,抗体：,理,理论上,在,在4,冰箱,内,内,可保存,半,半年左,右,右。,PBS,或抗体,稀,稀释液,稀,稀释的,抗,抗体：,一,一般,只可放,置,置1-,2,个月。,二、出,现,现假阳,性,性的原,因,因,组织切,片,片质量,不,不佳，,造,造成假,象,象，如,刀痕裂,缝,缝边缘,的,的组织,着,着色过,深,深，不,能,能作,为判断,阳,阳性的,依,依据。,出血和,坏,坏死：,红,红细胞,的,的内源,性,性过氧,化物酶,，,，坏死,细,细胞释,放,放的内,源,源性过,氧,氧化,物酶均,可,可出现,假,假阳性,反,反应。,抗体的,交,交叉反,应,应。,三、出,现,现假阴,性,性的原,因,因,固定时,间,间过长,，,，浸蜡,、,、烤片,温,温度过,高,高，导,致,致抗原,丢,丢失，,无,无法补,救,救。,固定液,不,不合适,或,或浓度,不,不对，,导,导致固,定,定不佳,。,。最好,使,使用10%中,性,性福尔,马,马林。,抗体浓,度,度过低,。,。,孵育时,间,间太短,，,，或孵,育,育温度,太,太低。,缓冲液,pH,值不正,确,确。,四、必,须,须严格,设,设置阳,性,性对照,和,和阴性,对,对照。,五、,DAB,有致癌,性,性，用,后,后不应,随,随处倒,弃,弃。,ThankYou!,9,、静夜四无,邻,邻，荒居旧,业,业贫。1月-231月-23,Friday,January6,2023,10,、雨中黄叶,树,树，灯下白,头,头人。19:57:3319:57:3319:57,1/6/2023 7:57:33 PM,11,、以我,独,独沈久,，,，愧君,相,相见频,。,。1月-2319:57:3319:57,Jan-2306-Jan-23,12,、故人江,海,海别，几,度,度隔山川,。,。19:5