组织培养的知识基础

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 组织培养技术的知识基础,第一页，共四十页。,一、组织培养的概念及评价,1.概念：Tissue culture P5,广义,：,器官培养：器官原基或部分器官在离体条件下，使之生,存生长保持一定功能的方法。,组织培养：取自生物体的组织块，切碎后离体培养。,细胞培养：用一定方法，使组织解离成分散游离的细,胞，离体培养。,狭义,：,即指细胞培养，指人工模拟体内环境，使离体细胞生,存，增殖，并维持一定的结构和功能的方法。,第二页，共四十页。,2、对组织培养技术的评价,在生命科学中广泛应用，经久不衰,从德国人Roux(1885)至今已有一百多年的历史,在生命科学各领域是一项最基础的实验技术，已经形成自己的理论体系。,应用范围：,生物基础,：细胞代谢与生理机能，细胞增殖，,细胞遗传，细胞凋亡，细胞信号传导。,医学基础,：生理、药理、病理、免疫、肿瘤、,血液学、遗传病。,应用研究,：育种，药物研发，生物制品，细胞,工程，基因工程等。,第三页，共四十页。,组织培养技术的优点,可长期提供生活细胞材料实验观察，甚至生物母体已经死亡之后（细胞冻存）,可供培养的细胞种类十分广泛，所有细胞生物的体细胞，从胚细胞-成体细胞（正常与疾病）,便于配合使用各种实验技术，如：各种光镜、电镜、组织化学、同位素标记。各种物、化、生物因子作用等。,增殖迅速，可人为杂交，甚至远缘杂交。,可同时提供大量生物性状相似的研究对象，离体细胞某些遗传性状保持相对稳定，仍保持完整的基因组。,第四页，共四十页。,组织培养的局限性,细胞离体培养，模拟体内环境的局限性（神经体液调节、免疫调节、细胞间的互作）。,离体细胞发生变异不可避免，其生命活动规律不能与体内细胞等同，所以实验结果不可等同于体内实验。,细胞实验模型不能取代动物模型和临床实验。,第五页，共四十页。,二、离体培养细胞的生物学特点,（一）、离体细胞的差异和分化,1.差异,：离体培养细胞,细胞在体内时的分化特征减弱，形态、机能趋单一化，如腺细胞分泌功能丧失；肾、肌、血管细胞均成纤维细胞化。,需进入持续增殖状态才能长期生存，所以衰退死亡加速。,某些细胞可能转化成不死细胞系，在适宜条件下获永生性。,第六页，共四十页。,2.分化,：,呈去分化趋势，表现为原体内细胞的特化功能丧失，形态归一，胚样细胞转化。（分化特征的暂时性丧失和永久性丧失）,有潜在的诱导新的分化方向的能力,条件,如：白细胞 转化成可合成Hb的细胞,微生素A酸,某白血病细胞株 向正常白细胞状态转化,据此可进行细胞分化的条件和控制机制的研究,第七页，共四十页。,仍保留体内细胞在寿命上的分化状态,胚细胞 可传代50代以上（300cycles）,成人细胞 可传代30代以上（150cycles）,老年人细胞 相应缩短,病危人细胞？,某些细胞离体条件下可获永生性,第八页，共四十页。,（二）、离体培养细胞的形态学分类,离体培养细胞的分类不同于体内，首先据其在培,养器中的生长特征分成两大类：P7,1.悬浮型细胞,：离体培养时，细胞不贴附于支持物上生长增殖，而是悬浮于培养液中，呈球形,2.贴附型细胞,：细胞离体培养时，依赖于贴附培养器底壁才能增殖，依据形态特征又可分为：,第九页，共四十页。,1）成纤维型：细胞贴壁后与体内成纤维细胞形态相似的一类细胞。,形态,:呈棱形或不规则三角形，细胞间隔不定，细胞质外伸突起，细胞核卵圆形，细胞增殖达一定密度后呈火焰状单层生长,起源：,由中胚层分化起源的组织细胞，体内时形态各异，离体后形态归一。如：心肌细胞，平滑肌细胞，成骨细胞，血管细胞，肾细胞，输尿管细胞，生殖系细胞等,第十页，共四十页。,2）上皮型细胞 P7 图2-1,形态,：贴壁后，细胞呈扁平，不规则多角形，圆形细胞核居中，细胞间排列紧密，间隔均匀。,起源,：由内外胚层分化的组织细胞。如：消化道上皮细胞，肝、胰腺、肺气管上皮细胞、尿道和膀胱上皮细胞等。,肺泡型上皮细胞,第十一页，共四十页。,3）游走型细胞：散在生长，活跃游动，变形。贴壁后不成片，在一定条件下，可类似成纤维细胞形，也可呈多角形，类上皮型细胞。,4）多形型细胞：指某些无规律性的形态特征的细胞。如：神经组织细胞。,游走型细胞 多形型细胞,第十二页，共四十页。,（三）不同生长状态培养细胞的形态学鉴定,健康生长 生长不良 恶性转化,光镜下：伸展好 折光性弱 细胞皱缩折光性强 伸展差 折光性强,均质透明 细胞轮廓明显 核膜核仁轮廓明显,结构轮廓不明显 细胞质中有空泡 核糖体颗粒丰富,核质比例小 颗粒 核质比例增大,核仁小而少 2n体 核仁增多,单层生长 细胞可重叠生长,2n体 异倍体常见,电镜下：细胞表面微绒毛少 微绒毛增多,细胞质中微管微丝规则 微管微丝紊乱,第十三页，共四十页。,（,四）离体细胞的生长增殖规律,细胞离体培养时，表现出不同于体内的生长、增殖规律,1.离体培养细胞的生命期特点 p9,离体细胞的生命期:指从组织取材，细胞接种培养，经原代培养期、传代期，持续生长增殖，直至细胞增殖停滞、死亡经历的时间。大多2n体离体细胞可传代30-50代。,细胞传代：细胞在培养液中增殖达一定密度后，需进行分瓶再接种，更换培养液，再培养。这一过程叫细胞传代。,细胞周期：概念同体内细胞，传一代一般增殖3-6个细胞周期。,第十四页，共四十页。,离体培养细胞的生命周期曲线（见P9图2-2）,（图略）,原代培养期：从体内组织取材，细胞接种，到第一次传代止。,历时,：1-4周（不同类型细胞，不一）,特点,：细胞异质性强，活跃迁移，细胞暂时不分,裂，贴壁后才开始分裂，与体内组织相似性,大，适于药物研究。,第十五页，共四十页。,传代培养期:原代细胞一经传代则进入持续增殖，定期传代过程，直至增殖缓慢以致完全停止。,历时,：2n体细胞一般可传30-50代，一般每周传,1-2代。,特点,：细胞增殖旺盛，需及时传代。建立细胞系,一 般在10代内冻存，持续传代可能发变,异，有的可产生永生细胞系。,衰退期：,从细胞增殖缓慢 停止 死亡,特点,：细胞仍然生存，但在换液后，优越环境下,也不再增殖，细胞死亡。,第十六页，共四十页。,2.传代期细胞的一代生长过程（见P10图2-3）,1）潜伏期：,概念,：细胞接种后，先呈悬浮状态游离于培养液中,细胞贴壁过程,细胞贴壁后，有一个暂不增殖的潜伏阶段。,细胞贴壁过程,：促贴附物质被吸附于支持物表面,c膜表面阴电荷与支持物表面阳电荷互作,c膜蛋白参与贴附过程，c牢固贴壁。,影响贴壁的因素,：支持物表面质量和清洁度,促贴壁物质，纤维连接素,c膜表面蛋白特性,第十七页，共四十页。,2）指数增殖期：是一代细胞增殖旺盛阶段直至细胞培养器生长面被细胞铺满一层。,细胞增殖率：指某一刻，增殖细胞占c总数的比例,细胞增殖率的极限点和细胞数增大极限点,指数增长期：一代细胞活力最佳期，是用于各种实验的最佳期。,3）平顶期：又称停滞期，细胞培养的生长面达饱和密度，产生接触抑制作用，增殖近停止，或可认为增殖细胞数与死亡细胞数达成平衡。,特点,：细胞增殖停止，代谢继续，营养枯竭，产,物堆积，PH下降，如不及时传代，则细胞,产生毒化效应而死亡。,第十八页，共四十页。,3.细胞周期和细胞增殖动力学,1）50年代以来传统的细胞周期概念,2）新细胞增殖动力学理论,（板图示之略）,体内外细胞都存在的两种基本状态：增殖态,功能态,增殖态细胞进行：细胞质复制、细胞核复制、细胞分裂三个连续过程，完成一次称1个细胞周期。G1 S G2 M共同构成细胞增殖期，不可分割。,第十九页，共四十页。,功能态细胞：指细胞完成某次分裂后，进行特定功能活动（如分泌、搜索、吞噬），是细胞一种分化态。命名为G,0,期细胞。新理论认为其不属于G1期，G0期处于两个增殖期中间，是真正意义的间期。,存在三种不同属性的G,0,期细胞：,G,0,i(G,0,of interphase):,是以增殖为主的细胞频繁分裂，G,0,期甚短，体内的某些干细胞，肿瘤细胞，离体培养细胞属于此种。,G,0,f,1,(G,0,of function 1,)是以功能活性为主的细胞，G,0,期细胞进行分化后的功能活动，但一定条件下，可重返增殖状态。如体内腺细胞，肝细胞。,第二十页，共四十页。,G,0,f,2,(G,0,of function 2),：是终末分化细胞，长期处于G,0,期，始终完成分化功能。如：神经细胞、骨骼肌细胞等。在体外难培养成功。,细胞脱离了增殖态，经功能态，再一次进入增殖态后称为一个细胞增殖周期，这不同于传统的细胞周期概念,离体培养细胞，必须进入持续增殖状态才能生存，,G,0,i时间很短，但营养不良，生长因子缺乏，可停留于G,0,i状态，如及时补加营养因子，可进入增殖状态，否则细胞会因长期滞留在G,0,i态而死亡。,第二十一页，共四十页。,三、离体培养细胞的生存条件 p11,（一）无污染环境,无毒害物：化学毒物、强酸碱等。,措施：浸泡、刷洗、浸酸、水洗、晾干。,无微生物污染：细菌、支原体、病毒。,措施：物理灭菌：紫外照射,干热灭菌 （范围见p28表2-6）,高压灭菌,抽滤灭菌,化学灭菌：来苏尔、新洁尔灭等,操作防菌：无菌间、无菌服、超净工作台,抗生素：加入培养液 抑菌生长,第二十二页，共四十页。,（二）、温度：人和哺乳类细胞,最适温度：36.5,0.5,偏高温度：37-39，代谢强度过大呈正比,39-40 ，1h 细胞受损 但仍可恢复,41-42，1h细胞严重损伤 少量可复活,43 以上，1h细胞全部死亡,偏低温度：35-25,，,细胞仍可生存，生长不良,4 左右，几小时，回到37 仍可继续生长,0 以下，细胞死亡,加保护剂，-196 液氮中，可长期冻存，复苏后细胞,有较高成活率。,第二十三页，共四十页。,（三）气体环境和PH值,最适PH值：7.2-7.4（培养液中含指示剂）,PH7.2 橙红色,变碱 紫色,变酸 黄色,需主要气体：,氧气：细胞缺氧，不能生存，,封闭培养瓶培养（短期原代培养）,开放培养器皿持续传代培养（CO,2,培养箱）,CO,2,：,CO,2,培养箱可保持细胞培养环境CO,2,分压恒,定，PH相对稳定。,第二十四页，共四十页。,（四）基本营养需求,1.碳水化合物,2.氨基酸类,3.维生素类,4.激素类,5.微量元素,6.促细胞生长因子,天然培养基,：血清、血浆、胎汁等,人工合成培养基,：+血清（P16血清的作用）,第二十五页，共四十页。,（五）针对不同细胞培养物，培养条件的多样性,1.培养条件因培养对象不同而异,培养基：广普培养基和特殊针对性培养基。P17-18,血清：小牛血清、胎牛血清、无血清培养基+,纯化促细胞生长因子,各种特殊添加剂：针对不同培养物和不同实验目的,如：,外周血淋巴细胞：多种广谱性培地均可（1640）,+小牛血清（20%）,+植物血凝素（PHA）,第二十六页，共四十页。,2.细胞贴附底物需求的差异,1）一般贴壁细胞培养：高质量瓶壁支持面+促,细胞贴附物质（血清）,2）表皮细胞培养：在瓶壁支持面上涂胶原蛋白,3）肿瘤细胞克隆培养：,饲细胞层培养技术,：是用一层经射线照射的培养细胞层，作为克隆细胞培养的附着底物，这种细胞层失去分裂增殖能力，但仍然生存代谢，起到同化培养液的作用，称为饲细胞层。,第二十七页，共四十页。,3.细胞培养技术方法的多样性,1）消化方法：,胶原纤维多的组织，癌组织-用胶原蛋白酶消化,上皮组织，间质少的组织-用胰蛋白酶消化,不同组织细胞对酶的浓度和作用时间要求不同,2）细胞传代间隔时间：与培养细胞的特性和接种密,度、血清质量均有关。,3）细胞冻存方法：原代培养细胞：用DMSO,一般传代细胞：用甘油,第二