细胞工程基本技术

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,细胞工程,C,ELL,ENGINEERING,第二章 实验室及实验基本技术,一 实验室设置,二 基本技术,三 培养条件控制,一,.,实 验 室 设 置,实验室组成,基本设备配置,培养容器与用具,1,、实验室组成,实验准备,包括培养基配制，,洗涤与灭菌等,无菌操作,控制培养,Culture room,Preparation room,Sterili-,zing room,Sterile operation,Cytology room,Transi-,tion area,实验室布局示意图,基 本 实 验 室,准备室,准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。,接种室,接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。,辅 助 实 验 室,细胞学实验室,其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。,理化分析室,在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。,摄影室及暗室,其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。,2,、基本设备配置,常规设备,灭菌设备,培养设备,无菌操作设备,其它设备,常规设备,酸度计,电子天平,纯水器,大容量高压灭菌器,全自动手提式灭菌器,电热干燥箱,灭菌设备,Zeiss,滤器,超净工,作,作台,无菌操,作,作设备,培养设,备,备,高效培,养,养架,细胞学,研,研究设,备,备,流式细,胞,胞仪,3、培,养,养容器,与,与用具,二,.,基本技,术,术,洗涤,灭菌,培养基,接种,1,、洗,涤,涤,合成洗,涤,涤剂,铬酸洗,涤,涤液,常用的,铬,铬酸洗,涤,涤液配,方,方,成 分,强酸溶液,中酸溶液,弱酸溶液,重铬酸钾,(g),63,120,100,硫 酸,(ml),1000,200,100,蒸 馏 水,(ml),200,200,1000,注意事项,在蒸馏水中缓慢加入浓硫酸，加热的同时分次加入磨碎的重铬酸钾至其完全融解。,重铬酸钾加蒸馏水后加热溶化，冷却后再缓慢加入浓硫酸。,玻璃器,皿,皿洗涤新购置,的,的需稀,酸,酸浸泡,过,过夜，,洗,洗衣粉,刷,刷洗，,清,清水冲,洗,洗；用,过,过的洗,衣,衣粉刷,洗,洗，清,水,水冲洗,后,后备用,塑料用,品,品洗涤新购置,的,的即用,；,；用过,的,的冲洗,干,干净后,稀,稀碱浸,泡,泡过夜,，,，清水,冲,冲洗，,稀,稀酸浸,泡,泡,30min,，清水,冲,冲洗后,备,备用。,金属用,品,品洗涤金属用,品,品一般,不,不宜用,洗,洗涤液,洗,洗涤，,需,需要,清,清洗时,一,一般用,酒,酒精擦,洗,洗，然,后,后火焰,干,干燥。,培养基湿热灭,菌,菌，即,高,高压蒸,汽,汽灭菌,或,或过滤,灭,灭菌。,玻璃器,皿,皿湿热灭,菌,菌或干,热,热灭菌,，,，即在,烘,烘箱中,加,加热至,160,180,40min,，或,120,2h,。,金属用,具,具干热灭,菌,菌或浸,泡,泡于,70,酒精后,火,火焰灼,烧,烧。,操作环,境,境接种室,常,常采用,定,定期熏,蒸,蒸，熏,蒸,蒸剂常,采,采用甲,醛,醛加高,锰,锰酸钾,，,，一般,每,每,100ml,甲醛加,5g,高锰酸,钾,钾。,2,、灭,菌,菌,培养基,体,体积与,灭,灭菌时,间,间的关,系,系,培养基体积,（,ml,）,灭菌温度,（）,灭菌时间（,min.,）,20,50,121,20,50,500,121,25,500,5000,125,35,3、培,养,养基组,成,成及配,制,制,事实上,，,，培养,基,基的研,制,制始终,伴,伴随着,组,组培技,术,术的发,展,展，整,个,个组培,的,的发展,史,史就是,一,一部培,养,养基的,研,研制史,：,：,1902Haberlandtknop培,养,养液Suc,失,失败,1939White等,人,人,无,无,机,机有,机,机（V,B,）IAA,脱,脱,分,分化,1957Skoog&MillerCYT/IAA激,素,素调控,再,再,分,分化,1958Steward,首,首次,实,实现植,株,株再生里程碑,培养基,的,的名称,，,，一直,根,根据沿,用,用的习,惯,惯。多,数,数以发,明,明人的,名,名字来,命,命名，,如,如White,培,培养基,，,，Murashige和Skoog培养,基,基(简,称,称MS,培,培养基)，也,有,有对某,些,些成分,进,进行改,良,良，称,作,作改良,培,培养基,。,。,培养基,基,基本成,分,分,培养基,配,配方,培养基,配,配制,复合配,方,方培养,基,基基本,成,成分,基本培,养,养基,无,无机,有,有机,常用的,基,基本培,养,养基有,：,：,White,、,MS,、,B5,、,N6,等。,培养基,基,基本成,分,分,水是植物,原,原生质,体,体的组,成,成成分,，,，也是,一,一切代,谢,谢过程,的,的介质,和,和溶媒,。,。它是,生,生命活,动,动过程,中,中不可,缺,缺少的,物,物质。,配,配制培,养,养基母,液,液时要,用,用蒸馏,水,水，以,保,保持母,液,液及培,养,养基成,分,分的精,确,确性，,防,防止贮,藏,藏过程,发,发霉变,质,质。大,规,规模生,产,产时可,用,用自来,水,水但在,少,少量研,究,究上尽,量,量用蒸,馏,馏水，,以,以防成,分,分的变,化,化引起,不,不良效,果,果。,无,机,机,盐,盐,类,类,大量,元,元素大量,元,元素,使,使用,量,量一,般,般每,升,升几,十,十至,几,几千,毫,毫克,。,。大,量,量元,素,素包,括,括,C,、,H,、,O,、,N,、,P,、,K,、,Ca,、,Mg,、,S,。,微量,元,元素微量,元,元素,的,的用,量,量一,般,般低,于,于,10,-5,10,-7,mol/L,。植,物,物所,需,需微,量,量元,素,素有,Fe,、,Cu,、,Zn,、,B,、,Mo,、,Mn,、,Co,。,有,机,机,成,成,分,分,糖,维,维生,素,素,肌,肌醇,腺,腺,嘌,嘌呤,氨,氨,基,基酸,其,其它,复,复合,成,成分,a-1,，,，2-,苷键,或,或,b-2，1-,苷键,-D-,葡萄,糖,糖,-D-,果糖,蔗糖,生物,素,素即维,生,生素,H,，它,是,是多,种,种羧,化,化酶,的,的辅,酶,酶。,在,在生,物,物合,成,成中,起,起传,递,递和,固,固定,CO,2,的作,用,用。,肌醇又称,环,环己,六,六醇,，,，广,泛,泛分,布,布在,动,动物,和,和植,物,物体,内,内。,最,最早,从,从心,肌,肌和,肝,肝脏,中,中分,离,离得,到,到。,环,环己,六,六醇,在,在自,然,然界,存,存在,有,有多,个,个顺,反,反异,构,构体,，,，但,有,有价,值,值的,、,、天,然,然存,在,在的,异,异构,体,体为,顺,顺-1,，,，2,，,，3,，,，5-反-4,，,，6-环,己,己六,醇,醇即,肌,肌肉,肌,肌醇,，,，结,构,构式,如,如右,，,，,是磷,脂,脂的,一,一种,磷,脂,脂酰,肌,肌醇,的,的组,成,成成,分,分。,在糖,类,类的,相,相互,转,转化,、,、维,生,生素,和,和激,素,素的,利,利用,等,等方,面,面具,有,有重,要,要的,促,促进,作,作用,。,。,myo-inositol,腺嘌,呤,呤的作,用,用首,先,先是skoog和Tsui,于,于1948年,发,发现,的,的，,他,他们,在,在实,验,验室,中,中观,察,察到,，,，使,用腺,嘌,嘌呤,能够,刺,刺激,烟,烟草,茎,茎段,不,不定,芽,芽的,发,发生,。,。以,后,后的,研,研究,表,表明,，,，腺,嘌,嘌呤,是,是合,成,成各,种,种细,胞,胞分,裂,裂素,的,的前,体,体物,质,质之,一,一。,外,外源,添,添加,酰,酰嘌,呤,呤具,有,有促,进,进细,胞,胞自,身,身合,成,成细,胞,胞分,裂,裂素,的,的功,能,能，,有,有利,于,于细,胞,胞的,分,分裂,和,和分,化,化，,促,促进,芽,芽的,形,形成,和,和生,长,长。,氨基,酸,酸是蛋,白,白质,组,组成,成,成分,。,。常,用,用氨,基,基酸,为,为甘,氨,氨酸,及,及多,种,种氨,基,基酸,的,的混,合,合物,，,，如,水,水解,酪,酪蛋,白,白，,水,水解,乳,乳蛋,白,白等,。,。,天然,复,复合,物,物：大,多,多含,氨,氨基,酸,酸、,激,激素,、,、酶,等,等一,些,些复,杂,杂化,合,合物,。,。它,对,对细,胞,胞和,组,组织,的,的增,殖,殖与,分,分化,有,有明,显,显的,促,促进,作,作用,。,。由,于,于成,分,分复,杂,杂，,实,实验,可,可重,复,复性,差,差，,应,应尽,量,量不,用,用或,少,少用,。,。但,有,有时,大,大胆,启,启用,此,此类,物,物质,可,可能,起,起到,意,意想,不,不到,的,的效,果,果。,常,常用,的,的有,：,：,CH,（,（水,解,解酪,蛋,蛋白,）,）、CM,（,（椰,子,子汁,）,）、,ME,（,（麦,芽,芽浸,提,提物,）,）、YE,（,（酵,母,母浸,提,提物,）,）、,TJ,（,（番,茄,茄汁,）,）、,香,香蕉,、,、马,铃,铃薯,等,等。,植,物,物,激,激,素,素,生长,素,素,细胞,分,分裂,素,素,其它,植物,激,激素,，,，是,植,植物,新,新陈,代,代谢,中,中产,生,生的,天,天然,化,化合,物,物，,能,能以,极,极微,小,小的,量,量影,响,响到,植,植物,的,的细,胞,胞分,化,化、,分,分裂,、,、发,育,育，,影,影响,到,到植,物,物的,形,形态,建,建成,、,、开,花,花、,结,结实,、,、成,熟,熟、,脱,脱落,、,、衰,老,老和,休,休眠,以,以及,萌,萌发,等,等许,多,多的,生,生理,生,生化,活,活动,，,，在,培,培养,基,基的,各,各成,分,分中,，,，植,物,物生,长,长调,节,节物,是,是关,键,键物,质,质，,对,对植,物,物组,织,织培,养,养起,着,着决,定,定性,作,作用,，,，它,的,的运,用,用也,是,是植,物,物细,胞,胞工,程,程研,究,究的,重,重要,的,的基,本,本方,法,法。,生长素类,(auxin),吲哚乙酸,(IAA),、吲哚丁,酸,酸,(IBA),、萘乙酸,(NAA),、,2,4-,二氯苯氧,乙,乙酸,(2,4-D),细胞分裂,素,素类,(ctytokinin),激动素,(KT),、,6-,苄基嘌呤,(6-BA),、异戊烯,腺,腺嘌呤,(2-ip),、玉米素,(ZT),赤霉素类,( gibberellins)GA,3,脱落酸,(abscisic),乙烯,(ethylene,）,Auxin,体内可增,强,强,RNA,和蛋白质,的,的合成，,促,促进细胞,伸,伸长和分,裂,裂，使保,持,持顶端优,势,势，刺激,生,生根等；,体外促进,离,离体细胞,分,分裂形成,愈,愈伤组织,，,，或者是,诱,诱导试管,苗,苗生根；,IAA,见,光,光,易,易,分,分,解,解,，,，,IBA,、,NAA,和,2,4-D,稳,定,定,，,，,是,是,组,组,培,培,中,中,常,常,用,用,的,的,生,生,长,长,素,素,；,；,不,同,同,的,的,生,生,长,长,素,素,生,生,理,理,活,活,性,性,的,的,强,强,度,度,不,不,同,同,，,，,IAA,、,NAA,和,2,4-D,的,强,强,度,度,比,比,约,约,为,为,1,：,10,：,100,Ctytokinin,体,内,内,可,可,促,促,进,进,细,细,胞,胞,分,分,裂,裂,和,和,器,器,官,官,分,分,化,化,，,，,终,终,止,止,种,种,子,子,和,和,芽,芽,的,的,休,休,眠,眠,，,，,打,打,破,破,顶,顶,端,端,优,优,势,势,等,等,；,；,体,外,外,诱,诱,导,导,离,离,体,体,培,培,养,养,的,的,芽,芽,形,形,成,成,丛,丛,生,生,芽,芽,，,，,诱,诱,导,导,离,离,体,体,组,组,织,织,的,的,细,细,胞,胞,的,的,增,增,殖,殖,并,并,再,再,生,生,不,不,定,定,芽,芽,；,；,与,生,生,长,长,素,素,合,合,用,用,有,有,增,增,效,效,作,作,用,用,，,，,按,按,不,不,同,同,的,的,比,比,例,例,配,配,合,合,可,可,产,产,生,生,不,不,同,同,的,的,效,效,果,果,赤,霉,霉,素,素,存,在,在,于,于,从,从,真,真,菌,菌,到,到,高,高,等,等,植,植,物,物,中,中,的,的,化,化,合,合,物,物,，,，,共,共,20,余,种,种,，,，,其,其,中,中,GA,3,为,组,组,培,培,中,中,常,常,用,用,；,；,体,内,内,主,主,要,要,功,功,能,能,为,为,促,促,进,进,细,细,胞,胞,的,的,伸,伸,展,展,和,和,茎,茎,叶,叶,的,的,伸,伸,长,长,等,等,；,；,组,培,培,中,中,主,主,要,要,用,用,于,于,诱,诱,导,导,离,离,体,体,芽,芽,的,的,萌,萌,动,动,和,和,伸,伸,长,长,乙,烯,烯,是,植,植,物,物,正,正,常,常,代,代,谢,谢,的,的,一,一,种,种,产,产,物,物,，,，,微,微,量,量,即,即,可,可,引,引,起,起,植,植,物,物,体,体,的,的,许,许,多,多,反,反,应,应,；,；,体,内,内,主,主,要,要,功,功,能,能,为,为,加,加,速,速,果,果,实,实,的,的,成,成,熟,熟,和,和,组,组,织,织,的,的,老,老,化,化,；,；,对,组,组,织,织,培,培,养,养,物,物,的,的,生,生,长,长,、,、,胚,胚,胎,胎,发,发,生,生,或,或,芽,芽,的,的,形,形,成,成,产,产,生,生,抑,抑,制,制,作,作,用,用,，,，,应,应,设,设,法,法,抑,抑,制,制,培,培,养,养,物,物,产,产,生,生,乙,乙,烯,烯,脱,落,落,酸,酸,发,现,现,于,于,研,研,究,究,桦,桦,树,树,芽,芽,的,的,休,休,眠,眠,和,和,棉,棉,花,花,脱,脱,叶,叶,中,中,；,；,体内主要功,能,能广泛，包,括,括启动种胚,发,发育后期的,脱,脱水过程，,促,促使芽和种,子,子进入休眠,状,状态等；,组培中很少,使,使用，一般,只,只在胚胎发,育,育和胚状体,诱,诱导实验中,应,应用，可抑,制,制胚胎的过,早,早萌发,IAA由,顶,顶端分泌，,诱,诱导细胞分,裂,裂，促进生,根,根,常用种类,：,：IAA、IBA、NAA、2,4-D等,使用效价：IAAIBANAA2,4-D,NAA、IBA 生,根,根培养,2,4-D,愈伤组织,诱,诱导与增殖,用量：mg/L级，mg/L=ppm,用法：溶,于,于95乙,醇,醇或0.1mol/LNaOH,CYT由,根,根尖分泌，,促,促进细胞分,裂,裂、促生芽,常用种类,：,：KT、6-BA、2-ip、ZT等,使用效价：KT6-BA2-ipZT,用量：mg/L级,用法：溶,于,于0.5mol/L稀HCl或稀NaOH，,通,通常多用NaOH助溶,。,。,CYT,IAA,的结,合,合是,实,实现,器,器官,发,发生,很,很好,的,的配,合,合式,!,激素,配,配比,模,模式,生长,素,素与,细,细胞,分,分裂,素,素的,比,比例,决,决定,着,着发,育,育的,方,方向,，,，即,长,长愈,伤,伤组,织,织、,长,长根,还,还是,长,长芽,。,。如,为,为了,促,促进,芽,芽器,官,官的,分,分化,，,，应,除,除去,或,或降,低,低生,长,长素,浓,浓度,，,，或,调,调整,培,培养,基,基中,生,生长,素,素与,细,细胞,分,分裂,素,素的,比,比例,。,。,高,有,有利于,根,根的形,成,成和愈,伤,伤组织,形,形成生,长,长素/,细,细胞分,裂,裂素,适,适中,有,有利于,根,根芽的,分,分化,低,有,有利于,芽,芽的形,成,成,生长调,节,节物质,的,的使用,甚,甚微，,一,一般为mgL级。,在,在组织,培,培养中,生,生长调,节,节物质,的,的使用,浓,浓度会,因,因植物,的,的种类,、,、部位,、,、时期,、,、内源,激,激素等,的,的不同,而,而异，,一,一般生,长,长素浓,度,度的使,用,用为0.05,5mg,L，,细,细胞分,裂,裂素0.05,10mgL,。,。,其它附,加,加成分,琼脂,活性炭,培养基,营,营养成,分,分对非,洲,洲紫罗,兰,兰,组织培,养,养的影,响,响,Growthmedium is optimisedforregeneration of plantlets,Nosucrose (0%,),Sucrose reducedto1%,Sucrose increasedto5%,Theexplantiscompletely coveredwithgreenshoots, androotsaredevelopingonthelowersurface,Very fewshootshavedevelopedonthe explant. No roots andnocallus.,Shootsdeveloped on edges of upper surface, andsome rootdevelopmenthas occured,Shootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfrom thelowersurface.Theresult is comparablewiththecontrolmedium,tissuecultureintheAfricanViolet,NoBAP,BAPreducedto0.1mg. l,-1,NoNAA,Poor shoot development andnoroots.Extensive callusgeneration,Poor shoot development andnoroots,NAAreducedto0.1mg. l,-1,More balanced development of roots andshoots. However, undifferentiatedcallus is developingatthe edges of theexplant,Profuse development of roots anda reducednumber of shoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesofthe explant,NAAincreased to 5.0mg.l,-1,Profuse development of roots overthe explantupperand lower surface, andfewshoots.Some callus,NoMSsalts,Nosign of regenerationfrom explantatall.,MSsaltsreduced to 0.47g.l,-1,Some rootgrowth butreduced development of shoots,MSsaltsincreasedto9.52g.l,-1,Shoots developedonupper surface ofexplant. Noroots or callus,.,常用培养,基,基配方,常用培养,基,基配方：,White,(,White, 1934,),MS(MurashingandSkoog,1962),B5 (Gambor et al, 1968),N6 (,朱至清，,1974),母液(stocksolution)的配,制,制和保存:,母液（贮,备,备液）：,根,根据实验,需,需要将试,剂,剂分类按,一,一定浓度,比,比例配制,成,成的浓缩,液,液。,目的：简,化,化操作、,保,保证精度,、,、方便冷,藏,藏；,方法：准,确,确称量、,分,分别溶解,、,、混合均,匀,匀、低温,保,保存（4,）；,培 养,基,基 配,制,制,母液配制,时,时可分别,配,配成：,大量元素,浓,浓缩,20,倍,I,微量元素,浓,浓缩,200,倍,II,铁盐,浓,浓,缩,缩,200,倍,III,有机物,浓,浓缩,200,倍,IV,激素,1mg/ml,或,1mg/10ml,母液配制,时,时应注意,的,的一些问,题,题：,一些离,子,子之间易,发,发生沉淀,，,，如Ca,2+,和S04,2+,，Ca,2+,、Mg,2+,和PO,4,3-,一起混合,后,后，会产,生,生沉淀，,一,一定要充,分,分溶解再,按,按一定顺,序,序放入母,液,液中。,用蒸馏,水,水或重蒸,馏,馏水配制,；,；药品应,该,该选取等,级,级较高的,化,化学纯或,分,分析纯；,药,药品的称,量,量及定容,都,都要准确,；,；先以少,量,量水让其,充,充分溶解,，,，然后依,次,次混合。,母液配,好,好后放人,冰,冰箱内低,温,温保存（4），,用,用时再按,比,比例稀释,。,。其中III、IV以及,激,激素类物,质,质应以棕,色,色瓶盛装。,贮备液,使,使用前摇,动,动瓶子，,如,如有沉淀,、,、絮状物,、,、微生物,污,污染应停,止,止使用。,培养基的,制,制备：,称量溶解Agar,加Suc溶解,加,加入母液,定容、,调,调PH,分装、封,口,口灭菌,、,、标记储,存,存,例1：配,制,制1L以,下,下培养基(母液已,配,配制，其,中,中激素浓,度,度,1mg/10ml),MSBA2NAA0.2Suc3.0,Agar0.8,MS：I50ml，II5ml,，,， III 5ml， IV 5ml,BA：20mlNAA,：,：2ml,Suc：30gAgar：8g,培养基的,选,选择：,培养基,基,基本培养,基,基植物,激,激素,（物质基,础,础） （,调,调控手段,）,）,生存,发,发展,培养基的,选,选择在实,质,质上讲就,是,是设计营,养,养物质与,激,激素（种,类,类、用量,）,）最佳组,合,合，实现,离,离体细胞,的,的生长、,分,分化与植,株,株再生。,而,而最佳组,合,合的结论,作,作出，需,要,要研制培,养,养基配方,并,并试验其,效,效果。,在建立一,个,个新的实,验,验体系时,，,，为了能,研,研制出一,种,种适合的,培,培养基，,最,最好先由,一,一种已被,广,广泛使用,的,的基本培,养,养基(如Ms培养,基,基或B5,培,培养基),开,开始。当,通,通过一系,列,列的实验,，,，对这种,培,培养基的,物,物质种类,、,、用量、,比,比例关系,作,作出适当,调,调整后，,即,即有可能,得,得到一种,能,能满足实,验,验需要的,新,新培养基,。,。选择最,佳,佳培养基,，,，常用试,验,验方法主,要,要有单因,子,子试验、,多,多因子试,验,验及广谱,实,实验等。,科学,安,安排,研,研究,顺,顺序,：,：,一、,基,基本,培,培养,基,基的,选,选择,：,：,通常,会,会以,一,一种,或,或几,种,种已,知,知的,基,基本,培,培养,基,基为,起,起点,，,，通,过,过实,验,验确,定,定出,合,合适,的,的营,养,养物,质,质水,平,平。,二、,激,激素,配,配比,的,的选,择,择：,通过,单,单因,子,子分,析,析、,多,多因,子,子实,验,验、,正,正交,实,实验,等,等方,法,法确,定,定出,最,最佳,激,激素,配,配比,模,模式,。,。,三、,糖,糖浓,度,度的,选,选取,：,：,大多,数,数植,物,物2,或3,，,，少,数,数4,；,花,花药,培,培养,时,时糖,浓,浓度,要,要求,较,较高,，,，7,15,，,主,主要,作,作用,在,在于,调,调节,基,基质,渗,渗透,压,压。,四、pH,值,值的,选,选取,：,：,植物,组,组织,对,对PH值,要,要求,不,不高,，,，一,般,般pH5.6,5.8，,个,个别,的,的喜,酸,酸或,喜,喜碱,，,，可,结,结合,植,植物,的,的生,长,长习,性,性适,当,当调,整,整，,也,也可,通,通过,单,单因,子,子分,析,析加,以,以确,定,定。,五、,综,综合,因,因子,的,的确,定,定：,在各,个,个单,项,项因,子,子的,条,条件,找,找到,后,后，,综,综合,进,进行,全,全面,实,实验,，,，并,根,根据,实,实验,情,情况,作,作出,适,适当,调,调整,，,，即,可,可确,定,定出,最,最佳,培,培养,基,基配,方,方。,4、,外,外植,体,体处,理,理及,接,接种,植物,离,离体,培,培养,类,类型,：,：,组织,培,培养,器官,培,培养,细胞,培,培养,原生,质,质体,培,培养,植物,材,材料,的,的培,养,养与,外,外植,体,体选,取,取,外植,体,体灭,菌,菌,接种,培,培养,及,及培,养,养条,件,件的,控,控制,植物,离,离体,培,培养,基,基本,程,程序,外植,体,体来,源,源,外植,体,体（explant）,是指,用,用于,离,离体,培,培养,的,的活,的,的植,物,物组,织,织、,器,器官,等,等材,料,料，,是,是植,物,物离,体,体培,养,养的,基,基础,材,材料,。,。,用于,外,外植,体,体分,离,离的,母,母体,植,植物,材,材料,一,一般,有,有三,种,种来,源,源：,一是,生,生长,在,在自,然,然环,境,境下,的,的植,物,物；,二是,有,有目,的,的地,培,培育,在,在温,室,室控,制,制环,境,境条,件,件下,生,生长,的,的植,物,物；,三是,无,无菌,环,环境,下,下已,经,经过,离,离体,培,培养,的,的植,物,物。,外植,体,体取,材,材,a.,根,根,据,据培,养,养需,求,求选,择,择植,物,物部,位,位,b.,多,多,年,年生,植,植物,注,注意,树,树龄,和,和季,节,节,c.,在,在,不,不影,响,响培,养,养目,的,的的,前,前提,下,下尽,可,可能,选,选择,自,自然,繁殖,器,器官,作,作外,植,植体,外植,体,体灭,菌,菌,外植体,清洗整理,杀菌剂灭菌,无菌水清洗,不同,外,外植,体,体,在灭,菌,菌剂,浓,浓度,、,、,时间,、,、程,序,序上,应有,所,所区,别,别,几种,常,常用,消,消毒,剂,剂的,效,效果,比,比较,1,、植,物,物细,胞,胞培,养,养环,境,境控,制,制,光照,温度,pH,气体,三,.,培养,条,条件,控,控制,光量指的,是,是光,照,照强,度,度，,因,因植,物,物类,型,型不,同,同而,异,异。,离,离体,培,培养,条,条件,下,下常,用,用的,光,光量,一,一般,为,为,1000,4000lx,。,光质即光,的,的波,长,长的,影,影响,。,。离,体,体培,养,养下,一,一般,用,用白,炽,炽荧,光,光灯,进,进行,光,光照,，,，光,谱,谱成,分,分主,要,要是,蓝,蓝光,，,，光,谱,谱波,长,长为,419nm,。在,离,离体,培,培养,中,中，,根,根、,芽,芽分,化,化的,依,依赖,光,光谱,成,成分,不,不同,。,。,光周,期,期指的,是,是光,照,照和,黑,黑暗,交,交替,的,的时,间,间，,影,影响,细,细胞,脱,脱分,化,化和,再,再分,化,化的,效,效应,。,。,光照,包,包括,：,：光,周,周期,、,、光,量,量和,光,光质,三,三方,面,面,在组,织,织培,养,养中,，,，温度不仅,影,影响,到,到细,胞,胞的,增,增殖,和,和分,化,化，,同,同时,在,在一,些,些特,殊,殊培,养,养中,常,常需,要,要采,用,用不,同,同的,温,温度,处,处理,。,。植,物,物组,织,织培,养,养常,用,用温,度,度范,围,围一,般,般在20,30,，,低,低于15,或,高,高于35,均,会,会影,响,响培,养,养物,的,的生,长,长。,植物,培,培养,通,通常,使,使用,的,的pH,值,值范围,是,是5.5,6.5,。,。pH在4.0,以,以下,或,或7.0,以,上,上,，,，,培,培,养,养,物,物,就,就,不,不,能,能,正,正,常,常,生,生,长,长,。,。,外,植,植,体,体,对,对,营,营,养,养,成,成,分,分,的,的,吸,吸,收,收,及,及,代,代,谢,谢,产,产,物,物,的,的,释,释,放,放,会,会,引,引,起,起,培,培,养,养,过,过,程,程,中,中,pH,变,变,化,化,高,压,压,灭,灭,菌,菌,会,会,引,引,起,起pH,变,化,化,培,养,养,物,物,的,的,生,生,长,长,需,需,要,要,氧,氧,气,气,。,。,培,培,养,养,室,室,的,的,透,透,气,气,程,程,度,度,和,和,培,培,养,养,容,容,器,器,的,的,封,封,闭,闭,程,程,度,度,均,均,会,会,影,影,响,响,到,到,培,培,养,养,过,过,程,程,中,中,的,的气,体,体,交,交,换,换，,进,进,而,而,影,影,响,响,培,培,养,养,物,物,的,的,生,生,长,长,状,状,态,态,。,。,细,胞,胞,工,工,程,程,技,技,术,术,的,的,核,核,心,心,是,是,无,无,菌,菌,操,操,作,作,和,和,培,培,养,养,实,验,验,室,室,建,建,设,设,在,在,满,满,足,足,技,技,术,术,要,要,求,求,的,的,同,同,时,时,要,要,经,经,济,济,、,、,高,高,效,效,和,和,实,实,用,用,设,备,备,配,配,置,置,应,应,根,根,据,据,工,工,作,作,性,性,质,质,而,而,定,定,培,养,养,基,基,是,是,细,细,胞,胞,生,生,长,长,的,的,必,必,须,须,营,营,养,养,，,，,需,需,根,根,据,据,细,细,胞,胞,类,类,型,型,确,确,定,定,适,适,宜,宜,配,配,方,方,适,宜,宜,的,的,外,外,植,植,体,体,是,是,离,离,体,体,培,培,养,养,的,的,前,前,提,提,。,。,光,光,照,照,、,、,温,温,度,度,是,是,植,植,物,物,离,离,体,体,培,培,养,养,的,的,基,基,本,本,条,条,件,件,小,结,结,1,、,、,名,名,词,词,解,解,释,释,：,：,细,胞,胞,全,全,能,能,性,性,；,；,外,外,植,植,体,体,；,；,脱,脱,分,分,化,化,；,；,再,再,分,分,化,化,；,；,愈,愈,伤,伤,组,组,织,织,2,、,、,拟,拟,配,配,制,制1LN6,贮,贮,备,备,液,液,，,，,请,请,计,计,算,算KNO,3,与ZnSO,4,7H,2,O,用,用,量,量,（,（,单,单,位,位,：,：mg,）,）,。,。,3,、,、,请,请,说,说,明,明,配,配,制,制1L,下,下,列,列,培,培,养,养,基,基,的,的,方,方,法,法(,母,母,液,液,已,已,配,配,置,置,好,好,，,，,请,请,计,计,算,算,各,各,母,母,液,液,用,用,量,量),MS,无,White,有,KT,0.1,BA,2,IAA,0.5,GA,30.2,椰,椰,乳,乳10%+,AC0.5%,KNO,3,400mg,Gly200mg,作,业,业,演,讲,讲,完,完,毕,毕,，,，,谢,谢,谢,谢,观,观,看,看,！,！,