实验三 叶绿体色素性质

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,叶绿体色素的提取、分离及,叶绿素,a,、,b,含量的测定,实 验 原 理,1.,脂溶性,叶绿体色素提取：,可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。,2.,分离：,（,1,）叶绿体色素的分离纸层析法,因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。,纸层析是以滤纸纤维为固定相，而以有机溶剂作为流动相。由于样品中各物质有不同的分配系数，移动速度因此而不同，从而达到分离的目的。,（,2,）叶绿素与类胡萝卜素的分离,叶绿素是一种二羧酸,叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇与叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。,根据朗伯,比尔定律，某有色溶液的吸光度,A,与其溶液浓度,c,和液层厚度,L,成正比，即：,A=,CL(,为吸光系数,),因此，根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，用公式即可计算出提取液中各色素含量。,测定,663nm,和,645nm,两个特定波长下的吸光度,A,，并根据叶绿素,a,、,b,在对应波长下的吸光系数即可求出叶绿素,a,、,b,含量。其校正过的公式为：,C,a,12.7A663,2.69A645 C,a,:,叶绿素,a,浓度,mg/L,C,b,22.9A645,4.68A663,C,b,:,叶绿素,b,浓度,mg/L,C,T,Ca+,Cb,C,T,:,叶绿素总浓度,mg/L,3.,叶绿素,a,、,b,含量的测定：,仪 器 药 品,剪刀,漏斗,烧杯,分光光度计,分液漏斗,铁架台,移液管,吸耳球,试管,毛细管,平底大试管,石英砂,碳酸钙,丙酮,乙醚,四氯化碳,无水硫酸钠,30%KOH-,甲醇溶液,天平,研钵,滤纸,操 作 步 骤,(,一,),1,叶绿体色素的提取,去中脉叶片,（,2g,左右），剪碎,放入研钵,研磨成匀浆,少量石英砂、碳酸钙,纯丙酮,5ml,深绿色提取液,再加纯丙酮,10ml,色素提取液,漏斗过滤,2,分离,叶绿体色素,（纸层析法）,4,叶绿素和类胡萝卜素的分离,(,皂化作用,),3,叶绿素理化性质观察,（二）叶绿体色素的分离（纸层析法）,1.,制备：,长条滤纸,(,宽,2*20cm),，将其一端剪去两侧，中间留一,0.5*1.5cm,的窄条。,2.,点样：,用毛细滴管吸取叶绿素溶液在窄条的上方点样,(,少量多次,),在平底试管中加推动剂,3-5mL(,四氯化碳,+,少量无水硫酸钠,),，把长条滤纸一端挂在橡胶塞下的大头针上，调节长度使纸条下端的窄条浸入推动剂中，注意色素点不可浸入。,3.,观察：,等到推动剂扩散至滤纸条上沿约,2cm,时,取出滤纸，铅笔标明推动剂边缘，观察分离后色素带的分布。,（三）叶绿素的理化性质,1,、荧光现象观察,取上述色素丙酮提取液少许于试管中，观察在反射光和透射光一侧提取液的颜色有无不同。,2,、铜代反应,取上述色素丙酮提取液少许于试管中，逐滴加入浓盐酸，直至溶液出现褐绿色；此时再加入醋酸铜晶体少许，慢慢加热溶液。,仔细观察，记录实验现象并解释原因。,3,叶绿素和类胡萝卜素的分离（皂化作用）,上层,色素乙醚,（用蒸馏水冲洗,12,次）,下层,丙酮水,（弃去）,色素提取液,（约,10ml,）,分液漏斗,（,10ml,乙醚）,摇动,静置,溶液分两层,20ml,蒸馏水,5ml 30%,KOH,甲醇溶液,用力摇动,静置,10,分钟,5ml,蒸馏水,摇动,静置分离,上层,？,下层,？,皂化反应,4,叶绿素和含量的测定,（分光光度法,）,1,、称取新鲜叶片（避开叶脉）,0.5g,，加纯丙酮,3ml,和少许碳酸钙、石英沙研磨成匀浆，转入离心管，用适量,80%,丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清液用,80%,丙酮定容至,10ml,。,2,、取上述色素提取液,1ml,，加,80%,丙酮,4ml,，混匀后转入比色皿，以,80%,丙酮为参比，分别测定,663nm,、,645nm,处的光密度值。,5,、按照公式计算色素提取液中叶绿素,a/b,以及,a+b,的浓度；再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量。,Ca,12.7A663,2.69A645,Cb,22.9A645,4.68A663,CT,Ca+Cb,8.02A663+20.21A645,波长,吸光度,645nm,A645=?,663nm,A663=?,叶绿素含量（,mg/g,）,=,（,C,T,提取液体积,稀释倍数）,样品鲜重或干重,注 意 事 项,纸层析时应尽量不使滤纸条边缘贴壁,分液漏斗的正规操作,有机溶剂的使用必须注意安全！,分光光度计的正规操作,