分子生物学实验-CLEC4M

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,CLEC 4M,基因多态性分析,基因多态性,多态性是指在一个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或,基因型,(genotype),或等位基因,(allele),，亦称,遗传多态性,(genetic polymorphism),或基因多态性。,DNA,片段长度多态性,基因多态性,DNA,重复序列多态性,单核苷酸多态性,DNA,片段长度多态性,(FLP),：,即由于单个碱基的缺失、重复和插入所引起,限制性内切酶,位点的变化，而导致,DNA,片段长度的变化，又称,限制性片段长度多态性,。,DNA,重复序列的多态性,(RSP),：,主要表现于重复序列拷贝数的变异 ，如,小卫星,DNA,和,微卫星,DNA,。,单核苷酸多态性,(SNP),：,即散在的单个,碱基,的不同，基因组中单核苷酸的缺失,插入与重复序列不属於,SNP,，但更多的是单个碱基的置换。,CLEC,是,C type,lectin,（,C,型凝集素）家族基因,CLEC4M,基因是,19,号染色体上,C,型凝集素家族中的一员，它被证明是多种传染性疾病病毒的受体，如,HIV-1, SARS-,Cov, HCV,等。该基因的第,4,外显子的,VNTR (Variable Number of Tandem Repeats,，,VNTR,),在全球人类群体中存在,3-9,次重复的多态现象，并被认为这种不同长度的多态可能和宿主对病毒的易感性有关。,CLEC4M,与,SARS,体内存在一种,SARS,冠状病毒的受体,L-SIGN,，,由,CLEC4M,基因所编码。该基因第,4,外显子存在,3-9,个,69,bp,的重复片段，人群中超过,50%,的人以,7,个重复为主，常见的基因型为,7/7,，,5/5,，,7/5,等不同的纯合或杂合状态，这个重复区编码位于胞外受体的颈部。研究表明，纯合型如,7/7,或,5/5,的个体较杂合型,7/5,的个体较少感染,SARS,病毒。,CLEC 4M,基因序列,实验原理,原理：用裂解液和蛋白酶,K,裂解口腔黏膜细胞，释放,DNA,，用浓盐法沉淀蛋白质，离心去除蛋白质，再用异丙醇沉淀,DNA,。,裂解液配方：,10mM,Tris-HCl,，,10mM,KCl, 10mM MgCl2, 2mM EDTA, 0.4M,NaCl, 1%SDS.,2PCR mix,ddH,2,O,引物,1,，引物,2,2PCR mix 10,l,引物,1,，引物,2,各,0.4,l,ddH,2,O 6.2,l,DNA,样品,3,l,PCR,反应体系， 总共,20,l,在,PCR,管盖上标记号码，便于辨认,放入,PCR,仪，并设置程序,变性,95, 5min,95, 20s,30,循环,59, 30s,72, 45s,延伸,72, 5min,PCR,过程大概,100,分钟,PCR,仪器界面和参数,紫外透射分析,点 样,将,PCR,扩增产物加入琼脂糖凝胶孔内，点样量,10,l,100bp DNA marker,，最亮的为,500bp,500bp,杂合子，根据位置判断为,589,和,727bp,。,杂带，分子量小，或是引物二聚体,结果分析,同学们，你们的基因是纯合还是杂合呢？,请继续思考,这种技术属于哪一种分子标记技术？,这种技术还可以用于哪些方面？亲子鉴定？,