工业发酵灭菌

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,工业发酵灭菌,知识目标,理解工业发酵常用灭菌方法的原理和适用范围,掌握工业发酵培养基和发酵设备灭菌工艺的选择,掌握无菌空气制备的基本知识和典型工艺要求,一、热灭菌法,1,、火焰灭菌法,直接在火焰上灼烧灭菌，如接种针和一些金属小工具、试管口、三角瓶口等灭菌采用这种方法，该方法简单有效，但局限性很大。,2,、干热灭菌法,进行干热灭菌时，微生物细胞发生氧化，微生物体内,蛋白质变性,和,电解质浓缩,引起中毒等作用，其中氧化作用导致微生物死亡是主要依据。由于微生物对干热的耐受力比对湿热强得多，故干热灭菌所需的温度要高，时间要长，一般,160,170,，,1,1.5h,。,实际应用时，对一些要求保持干燥的实验器具和材料可以采用干热灭菌法。,湿热灭菌法,利用饱和蒸汽进行灭菌的方法称为湿热灭菌法。,其原理是借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。,由于蒸汽有很强的穿透能力，湿热蒸汽存在潜热。,蒸汽来源方便，价格低廉，灭菌效果可靠，是目前最为常用的灭菌方法。一般的湿热灭菌条件为,121,，,30 min,。,湿热灭菌法,煮沸灭菌法,将要消毒的物品放入水中煮沸,（,100,）,15,20min,，一般微生物的营养细胞都可以杀死，但不能杀死芽孢。,巴氏消毒法,法国微生物学家、化学家巴斯德首创的低温消毒法。加热到,62,，经过,30,分钟，以杀死不耐高温的物质中的微生物和病原体的消毒法。,牛奶、啤酒、黄酒、酱油和醋等用此法消毒。,湿热灭菌法,间歇灭菌法,反复几次的常压蒸汽灭菌，以达到杀死微生物营养体和芽孢的目的。,操作步骤：,100,，,30-60min,；,37,，,1d,；同上重复三次,适用于不宜高压灭菌的物质，如糖类明胶牛奶培养基。,方法简单，但却麻烦；工作周期长。,湿热灭菌法,高压蒸汽灭菌法,使用密闭的高压蒸汽灭菌锅，使灭菌锅内蒸汽不外溢，增加压力，由于压力的增高，温度也随之增高，从而提高杀菌力，缩短灭菌时间。,最有效而广泛应用的灭菌方法,实验室常用的是,0.1MPa,，,121,，,15,30min,应用范围,培养基，水，发酵罐等其他不适合干热灭菌的物品。,高压蒸汽灭菌法的注意事项：,完全排除锅内冷空气,灭菌完毕后要缓慢减压,压力降为零后打开盖子,二、辐射灭菌法,利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物,以,紫外线,最常用。紫外线对芽孢和营养细胞都能起作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对紫外线的抵抗力强。紫外线的穿透力低，仅适用于表面灭菌和无菌室、培养间等空间的灭菌，且距照射物不超过,1.2 m,；对固体物料灭菌不彻底，也不能用于液体物料的灭菌。,三、化学药品灭菌法,某些化学药品与微生物发生反应（蛋白变性、酶失活、细胞通透性）而具有杀菌的作用。,化学药剂适于生产车间环境的灭菌，接种操作前小型器具的灭菌等，不适用于培养基。,化学药品的灭菌使用方法，根据灭菌对象的不同有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。,高锰酸钾,高锰酸钾溶液的灭菌作用是使蛋白质、氨基酸氧化，使微生物死亡，一般用,0.1,0.25,的溶液。,漂白粉,漂白粉的化学名称是次氯酸盐,(,次氯酸钠，,NaOCl),，它是强氧化剂，也是廉价易得的灭菌剂。它的杀菌作用是次氯酸钠分解为次亚氯酸，后者不稳定，在水溶液中分解为新生态氧和氯，使细菌受强烈氧化作用而导致死亡，对杀死细菌和噬菌体均有效。,75,酒精溶液,75,酒精溶液的杀菌作用在于使细胞脱水，引起蛋白质凝固变性。对营养细胞、病毒、霉菌孢子均有杀死作用，但对细菌的芽孢杀死作用较差。常用于皮肤和器具表面杀菌。,新洁尔灭,新洁尔灭是表面活性剂类洁净消毒剂。它在水溶液中以阳离子形式与菌体表面结合，引起菌体外膜损伤和蛋白变性。,10 min,能杀死营养细胞，但对细菌芽孢几乎没有杀灭作用。一般用于器具和生产环境的消毒，不能与合成洗涤剂合用，不能接触铝制品。,甲醛,甲醛,(HCHO),是强还原剂，它能与蛋白质的氨基结合，使蛋白质变性，对氨基和蛋白质的变性有较强活性，这是用甲醛作为灭菌剂的根据。使用时可以以,2,份,37,甲醛溶液与,1,份,KMnO,4,混合，或者将,37,甲醛溶液直接加热，产生气态甲醛用于灭菌。甲醛灭菌的缺点是穿透力差。,过氧乙酸,过氧乙酸是强氧化剂，它是广谱、高效、速效的化学杀菌剂，对营养细胞、细菌芽孢、真菌孢子和病毒都有杀灭作用。,戊二醛,在酸性条件下，不具有杀死芽孢的能力，只有在碱性条件下，才具有杀死芽孢的能力，常用,2,的溶液，常用于器具、仪器和工具等灭菌。,酚类,苯酚毒性较大，易污染环境，且水溶性差，使应用受到限制，而酚类衍生物的使用，扩大了作为消毒剂的使用范围。,四、臭氧灭菌,利用臭氧的氧化作用杀死微生物细胞。,氧化分解葡萄糖所必需的酶，从而直接破坏其细胞膜，从而将细菌杀死。,无污染消毒剂,对细菌、霉菌等杀菌效果好,安全，杀菌效果明显，安装灵活等特点,用于洁净室、净化设备的消毒。,五、过滤除菌法,利用过滤方法阻留微生物，也可达到除菌的目的，这就是过滤除菌法。,此法仅适用于澄清液体和气体的除菌。工业上常用过滤法大量制备无菌空气，供好氧微生物培养过程使用。,第二节 培养基和发酵设备的湿热灭菌,一、灭菌条件的选择,选择的原则：达到灭菌的目的，同时使培养基成分破坏减至最小。,1,、,灭菌温度和灭菌时间的选择,为什么选择,高温快速,灭菌？,温度升高，反应速率升高，,微生物死亡速率远大于营养成分的的破坏速率,灭菌程度与灭菌时间的影响,微生物的热死规律,对数残留定律,灭菌程度与灭菌时间的影响,微生物的热死规律,对数残留定律,微生物受热死亡的主要原因是高热能使蛋白质变性，这种反应可认为是单分子反应，死亡速率可视为一级反应，即与残存的微生物数量成正比。,式中,N,经时间,t,后残存的活菌浓度（个,/L),，,N,0,开始灭菌时原有活菌浓度（个,/L),；,t,灭菌时间（,s,min,）,K,灭菌速率常数或比死亡速率常数（,s,-1,min,-1,）它的大小与微生物的,种类,和加热,温度,有关。在同等温度下，其值小，微生物的耐热性强。,从上式得出：,t,N,之间的关系为对数,式中,N/N,0,菌体存活率，而,N,0,/N,为灭菌度。,t=,（,2.303/K,）,(N,0,/N),影响培养基灭菌的因素,培养基成分,油脂、糖类；低质量分数,(1,2,),的,NaCl,溶液,pH,值,pH,值,6.0,8.0,，微生物最耐热；,pH6.0,，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡,培养基中的颗粒,泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物,二、培养基的灭菌方法,（,1,）分批灭菌,分批灭菌是在每批培养基全部流入发酵罐后，就在罐内通入蒸汽加热至灭菌温度，维持一定时间，再冷却到接种温度。实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌。,不需要附属设备，操作简便，常用的灭菌方法,加热和冷却时间较长，营养随时间降低，罐利用率低；不能采用高温快速灭菌工艺。,发酵罐溶积越大，加热冷却时间越长,T,总,=t,1,+t,2,+t,3,式中,t,1,、,t,2,、,t,3,分别为加热、维持、冷却所需要的时间,其他灭菌设备一般采用蒸汽灭菌，如设备十分耐压，则可采用较高的温度，但必须注意设备内部的凹处及露出的小配管等蒸汽不能到达的部位。,（,2,）连续灭菌,连续灭菌也叫连消，是指培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的灭菌工艺流程。,其,温度一般以,126,132,为宜，总蒸汽压力要求达到,0.044,0.049MPa,以上。,优点,营养成分破坏少；发酵罐非生产占用时间短，溶积利用率提高；蒸汽负荷均衡，锅炉利用率高，操作方便；适用于自动化控制，降低劳动强度。,缺点,不适用于黏度大或固形物含量高的培养基的灭菌；增加了一套连续灭菌设备，增加了操作环节，增加了染菌的概率。,按设备和工艺条件分,（,1,）蒸汽直接加热,（,2,）蒸汽间接加热,1,、蒸汽直接加热连续灭菌系统,定义：,蒸汽通入培养基中，,快速加热至杀菌温度，维持一段时间，后冷却至发酵温度的过程。分两种形式：,（,1,）由连消塔、维持罐和冷却器组成,配料罐将培养基预热,60-70,，防止培养基在杀菌时料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。,连消塔使培养基迅速,(20s),升温,(126-132),。,维持罐：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。,2-7min.,冷却管：将培养基迅速冷却到,40-50,，输送到灭菌后的发酵罐内,连续灭菌流程,培养基配料 配料罐 加热器 维持罐 冷却器 无菌培养基,（,2,）喷射加热连续灭菌流程,由喷射加热、维持罐和真空冷却器组成的连续灭菌系统。,蒸汽直接喷入待灭菌的培养液，培养液急剧升温到预定的灭菌温度，培养基在该温度送入维持管维持一段时间后，通过一膨胀阀进入真空冷却器冷却。,保证培养基先进先出，避免过热或者灭菌不彻底,升温快、营养损失小,随着蒸汽的冷凝使培养基稀释,2,、蒸汽间接加热连续灭菌系统,蒸汽不直接与培养基接触，而是通过热交换器对培养基进行加热。,热交换器有板式和螺旋板式两种,螺旋板式交换器的特点：流道宽，流速快，可减少热交换器表面结垢现象。适用于含有固行悬浮物的培养基的灭菌。,板式交换器的特点：适用于含有少量固行悬浮物的培养基的灭菌。,温度随时间的变化,连续灭菌与分批灭菌的比较与选择,分批灭菌,优点：,1.,不需附加设备,2.,蒸汽利用率高,3.,节约劳动力,缺点,1.,培养基质量差,2.,罐的利用率低,3.,冷却水用量大,连续灭菌,优点：,1.,采用高温快速灭菌法,2.,可以把培养基按其性质分开灭菌,3.,有利于自动控制,4.,节省冷却水,缺点,1.,投资费用高,2.,对物料要求高,3.,蒸汽用量大,三、发酵设备灭菌,实罐灭菌时，发酵罐与培养基一起灭菌,连续灭菌时，发酵罐、种子罐等要先进行空罐灭菌。，维持,45-60min,。,空消后不能立即冷却，先保压，待培养基进入后，再开冷却系统。,附属设备：空气过滤器、补料系统和消泡剂系统等。,各个管路在灭菌前，要严格检查，以防泄露和“死角”的存在。,