碱性磷酸酶的分离纯化鉴定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,碱性磷酸酶的分离纯化,有机溶剂分步沉淀法,分离纯化的一般程序,选择材料,破碎细胞,提取,分离纯化,分析及鉴定,AKP,溶于,30%,乙醇、,33%,丙酮（,上清,中），,AKP,不溶于,60%,乙醇、,50%,丙酮（,沉淀,中），,原理：,操 作,一、取材及匀浆,取兔肝,2g,，剪碎，,加入,6ml 0.01mol/L,醋酸镁和醋酸钠,混合液，充分匀浆。,记录体积,（取,0.1ml,至一新,EP,管留作,A,液，测定时稀释,25,倍,）,二、提取,加入,2ml,正丁醇，搅拌,2min,，室温放置,30min,。过滤，,留上清,。,计体积。,三、分离纯化,1,、,50,丙酮沉淀,AKP,加入,等体积,丙酮，,3000rpm5min,，,留沉淀，,加,4ml,0.5mol/L,醋酸镁溶解沉淀，,记录体积,。,（取,0.1ml,留作,B,液,，稀释,10,倍,）,2,、,30,乙醇溶解,AKP,每,ml,溶液中加入,95,乙醇,0.46ml,2000rpm5min,，,留上清,（,记录体积,）,3,、,60,乙醇沉淀,AKP,每,ml,溶液中加入,95,乙醇,0.86ml,3000rpm5min,，,留沉淀，,加,3,ml,0.5mol/L,醋酸镁溶解沉淀，,记录体积,。,（取,0.1ml,留作,C,液，,使用时稀释,5,倍,）,4,、,33,丙酮溶解,AKP,每,ml,溶液中加入,0.33ml,丙酮,2000rpm5min,，,留上清,（,记录体积,）,5,、,50,丙酮沉淀,AKP,每,ml,溶液中加入,0.36ml,丙酮,3000rpm15min,，,留沉淀，,5ml,Ph8.8,的,Tris-,醋酸镁,溶解沉淀,（,D,液，不稀释,）,四、分析及鉴定,1,、碱性磷酸酶的活性测定（磷酸苯二钠法）,2,、碱性磷酸酶蛋白含量测定（,BCA,法）,3,、比活性及纯化倍数计算,分光光度法（,Spectrophotometry,）,根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收（即可产生吸收光谱）的特性而建立起来的一种,定量,、,定性,分析的技术。也称为吸收光谱法（,Absorption spectrometry,）。,不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来,（一）基本原理,光具有波粒二相性。,波长和频率是光的波动性的特征。,1,、光的基本知识,紫外分光光度计（,200,400nm,）,可见光分光光度计,（,400,760nm,）,红外分光光度计,（,760,1000nm,）,2,、定量分析的理论基础,LambertBeer,定律,A,KLC,吸光度,(Aabsorbance,A),消光度,(degree of extinction,E),光密度,(optical density,D),K,-,吸光系数,是物质的特征性常数。,对比法进行定量分析,A,样,=K L C,样,A,标,=K L C,标,A,样,A,标,K L C,样,K L C,标,C,样,C,标,C,样,=A,样,C,标,/A,标,单色光、平行光（,max,）,溶液均匀、清澈、无散射,溶液性质稳定，比色皿中无化学反应,适用于稀溶液（）,Lambert,Beer,定律的适用范围：,溶剂空白：当显色剂及所用其它试剂在测定波长都没有吸收峰时，可用纯溶剂,(,如蒸馏水,),作参比溶液。,试剂空白,：当显色前的样品在测定波长没有吸收峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，可用不加入样品的,“,试剂空白,”,作参比溶液，这种方式最为常用。,参比溶液的选择,基本组件及常见分光光度计,分光光度计的使用,1.,打开电源预热,15,分钟,2.,选择波长（,max,）,3.,光标指向,Trans,4.,打开光门，调节,0,；关上光门调节,100,5.,重复,4,一次,6.,将光标指向,ABS,7.,读数,磷酸苯二钠,碱性磷酸酶,苯酚,+,磷酸盐,碱性,苯酚,+4-,氨基安替吡啉,+,铁氰化钾,红色醌式化合物,AKP,活性测定基本原理磷酸苯二钠法,单位（,ml,）,空白管 标准管,A B C D,各阶段稀释液,酚标准液（,0.1mg/ml,）,Tris-,醋酸镁,复合底物液,/0.1 0.1 0.1 0.1,/0.1 /,0.1 /,3 3 3 3 3 3,酶活性单位（,U/ml,）,=,A,样,A,标,0.1,稀释倍数,37,保温,15,分钟,各管加入铁氰化钾液,2ml,，静置,15min,510nm,比色,酚标准液浓度,稀释倍数,(PH8.8tris,醋酸镁溶液）,/25 10 5 1,蛋白含量测定基本原理,BCA,法,蛋白质,+Cu,2,碱性,BCA,试剂,紫色化合物,Cu,二喹啉甲酸，,BCA,单位（,ml,）,空白管 标准管,A B C D,各阶段稀释液,蛋白标准液（,0.2mg/ml,）,蒸馏水,BCA,试剂,/0.1 0.1 0.1 0.1,/0.1 /,0.1 /,1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5,蛋白含量（,mg/ml,）,=,A,样,A,标,0.2,稀释倍数,37,保温,30,分钟,562nm,比色,蛋白标准液浓度,稀释倍数,(PH8.8tris,醋酸镁溶液）,/50 20 5 1,碱性磷酸酶比活性（,U/mg,）,=,样品的酶活性单位,样品的蛋白含量,纯化倍数,=,每一步比活性,初提液比活性,得率,=,每一步总活性,初提液总活性,计 算,每一步总活性,=,酶活性,每一部记录的体积数,