农杆菌转化原理及技术课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,颜静宛,水稻遗传转化已成为水稻分子生物学,研究和遗传改良的重要技术基础,几种常用植物基因转化方法的比较,转化方法,农杆菌法,PEG,法,电击法,微针注射法,基因枪法,受体材料,完整细胞,原生质体,原生质体,原生质体,完整细胞,花粉管通道法,卵细胞,宿主范围,组培条件,嵌合体比例,操作复杂性,设备要求,有,简单,有,简单,便宜,无,复杂,无,简单,便宜,无,复杂,无,复杂,昂贵,无,复杂,无,复杂,昂贵,无,简单,多,复杂,昂贵,有性繁殖植物,无,无,简单,便宜,工作效率,单子叶植物,应用,高,少,低,可行,低,可行,低,可行,高,广泛,低,广泛,农杆菌介导法的优点,?,操作简便,?,外源基因插入一般为单拷贝或低拷贝,?,转移,DNA,片段明确,?,可转移大片段,DNA,?,可直接用不同的植物组织进行基因转移,农杆菌介导遗传转化的原理,?,农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，分为发根农杆菌,（导致毛状根的发生）和根癌农杆菌（导致冠瘿瘤，,冠瘿瘤细胞可产生正常细胞不能产生的冠瘿碱）。,?,根癌农杆菌含有可向植物转移并使植物致瘤的质粒（,Ti,质粒）。,?,根癌农杆菌的,Ti,质粒包括毒性区（,Vir,区）、结合区（,Con,区）、复制起始区（,Ori,区）和,T-DNA,区四个部分,，其中与冠瘿瘤生成有关系的是,Vir,区和,T-DNA,区。,?,T-DNA,区左右边界各有,25bp,的重复序列，其中,14bp,是,核心，分,10bp,（,CAGGAATATAT),和,4bp,（,GTAA),不连,续的两组，是完全保守的。,?,Vir,区为,30Kb,由,VirA,、,VirB,、,VirC,、,VirD,、,VirG,、,VirH,等七个操纵子共,24,个基因起共调控作用。,Ti,质粒结构示意图,农杆菌侵染过程,?,损伤的植物细胞产生植物,酚类,作为农杆菌的侵染信号,;,?,这些化学诱导物透过农杆菌的细胞膜,活化,virA,和,virG,基,因,再诱导,Vir,区的其他基因,;,?,Vir,基因的活化,作用于,T-DNA,的,加工,及,T-DNA,的,转移,;,?,T-DNA,进入植物细胞后,整合,到核,DNA,上,;,?,T-DNA,在植物细胞中,表达,产生冠瘿碱及植物激素,;,?,农杆菌,Ti,质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基因,(ocs),该基,因启动合成各种酶,分解植物细胞产生的冠瘿碱作为惟一,的碳源和氮源,;,?,冠瘿碱促进农杆菌的附着及激活,tra,基因有利于,Ti,质粒的,接合转移,扩大侵染范围,根癌农杆菌通过基因转化把,T-DNA,上的基因,导入植物细胞并整合到核,DNA,上。,Biology of A.tumefaciens,Well known to induce crown gall tumor,A.tumefaciens,lives around,root surfaces(in,rhizosphere),where it using nutrients,that leak from the root tissues,infects only through wound sites,and actively chemotactic to them,Bacterial T-plasmid,produces,receptors,for acetosyringone,Plant,wound produces,acetosyringone,Produce callus,?,transform callus,?,stimulate shooting by cytokinin addition,+cytokinin,This procedure is easy,for dicotyledone plants,(legumes etc),Agrobacterium tumefaciens,Ti plasmid with,the new gene,+,Agrobacterium,Plant cell,cell,s,DNA,Transformation,The new,gene,Transgenic plant,Cell division,农杆菌介导转化水稻的方法,水稻（籼稻）根癌农杆菌转化技术流程,愈伤诱导,NB,培养基为基本,培养基加入相应,植物生长调节剂,共培养,第一天（预培养）,整,个,操,作,过,程,约,需,8,天,第三天（划菌）,第五天（侵染、共培养,),第八天（脱菌、筛选）,抗性愈伤的筛选与,再生成完整植株,技术关键：,诱导与培养,“,状态良好,”,的胚性愈伤组织；用于转化的胚性愈伤的继代次数不超过,8,代；高密度根农杆菌液侵染与共培养；干燥处理；共培养后有效去,除农杆菌或者抑制农杆菌生长（合适的抗生素及其浓度）；快速筛选（,2-3,次筛选）；迅速分化再生。,一、,培养基,?,基本培养基为,NB,培养基，愈伤诱导、转化及分化,等培养基配方如下：,?,1.,诱导培养基：,NB+2,4-D2 mg,L,-1,；,pH 5.8-5.9,。,?,2.,预培养培养基：,NB+2,4-D2 mg,L,-1,；,pH 5.8-5.9,。,?,3.,共培养培养基：,NB+2,4-D2 mg,L,-1,+AS100 M,L,-1,；,pH 5.2,。,?,4.,选择培养基,：,NB+2,4-D 2mg,L,-1,+,羧苄青霉素,250mg,L,-1,+Hyg 30-,50 mg,L,-1,，,pH 5.8-5.9,。,?,5.,分化培养基：,NB+KT10mg,L,-1,+NAA0.4 mg,L,-1,；,pH 5.8-5.9,。,?,6.,生根培养基：,1/2MS,；,pH 5.8-5.9,。,二、胚性愈伤组织的诱导及继代,?,取水稻授粉后,15-20d,的未成熟穗，将未成熟种子剥,壳，用,75%,乙醇浸泡,1min,，再转入,25,的次氯酸钠,溶液中振荡灭菌,25min,，于超净工作台中无菌水冲,洗,3-5,次，将消毒后种子的幼胚挑出并接种于诱导,培养基中，每皿约,30,粒，于,28,暗培养,7d,，切除,胚根，继续培养,7d,，待愈伤长大后进行继代培养,。从第三代开始可以选择适当的胚性愈伤用于农,杆菌转化。,胚性愈伤,三、农杆菌介导转化水稻,?,1.,愈伤组织的预培养,?,选取自然分散、颜色鲜黄、直径约为,2-3mm,的颗,粒状愈伤，转接到预培养培养基中，置于,27,暗,培养,4,天。,?,2.,农杆菌的培养及处理,?,从低温（,-85,）,冻存管中刮取少量菌液于附加,Kan50 mg,L,-1,和,Rif50 mg,L,-1,YEB,固体培养基划线，然后在,28,暗培养,3672h,进行活化；取活化平板上的单菌落转接划菌，,28,培,养两天后，用适量添加有,100M,L,-1,乙酰丁香酮（,AS,）的,AAM,培养基将菌洗脱，悬浮于添加有,100M,L,-1,乙酰丁香酮,20,ml AAM,培养基中，剧烈摇动,1min,后，调整菌液浓度至,OD,600nm,=1.52.0,，静置,1h,，以便让农杆菌形成悬浮液。,?,3.,共培养,?,取经预培养的愈伤于灭菌的培养瓶中，加入上述处,理的农杆菌菌液，略微摇动后静置,30min,，于无菌滤,纸上晾干愈伤后接种于共培养基，,25,暗培养,3d,。,?,4.,洗除农杆菌,?,挑取共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲,洗,3-5,次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。,最后一次用含,250 mg,L,-1,羧苄青霉素的无菌水静置,1h,，然后置于无菌滤纸上晾干。,?,5.,愈伤组织的筛选,?,将愈伤转移至选择培养基筛选抗性愈伤，每两周转,接,1,次。,抗性愈伤,非抗性愈伤,?,6.,抗性愈伤组织的继代与植株的再生,?,每两周将愈伤转移至新选择培养基上，约需三周即,可见瘤状鲜黄色抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中长出,。待愈伤长大后挑选抗性愈伤的一部分转移至分化,培养基上。,2,周后愈伤开始转绿，,3,周后即可长出幼,芽，随后根也长出。将幼苗移至生根培养基上，每,培养瓶,1,个克隆。待幼苗生根长成后，移出培养瓶，,洗净根上的培养基后，移至温室盆栽。,?,抗性愈伤的分化,抗性苗的生根,?,转基因植株田间种植,转化率、分化率和共转化率的计算,?,抗性愈伤获得率（,%,）,=,抗性克隆数,/,转化克隆数,100%,?,绿苗率（,%,）,=,再生克隆数,/,抗性克隆数,100%,