HPLC在药代动力学中的应用

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,HPLC,在药代动力学中的应用,药代动力学,实验材料及准备,LC-MS/MS,分析,结果分析,By:,花生,PPTer,主要内容,By:,花生,PPTer,药物代谢动力学（,Pharmacokinetic,，,PK,）是,定量,研究药物在生物体内,吸收,Absorption,、,分布,Distribution,、,代谢,Mechanism,和,排泄,Excretion,规律，并运用数学原理和方法阐述,血药浓度,随时间变化的规律的一门学科。,机体对药物的作用,By:,花生,PPTer,药代动力学的目的,不同剂型对药物吸收的影响,不同人种（或人群）对药物代谢的影响,不同人群对药物排泄的影响,指导药物开发,指导后期临床试验,指导临床合理用药,By:,花生,PPTer,吸收,吸收（,absorption,）：药物自给药部位,进入,血液循环,的过程。,消化道吸收（口腔，胃肠道吸收）,消化道外吸收（注射，呼吸道，皮肤粘膜吸收）,顺序：静脉、吸入、腹腔注射、舌下含化、肌肉注射、皮下注射、口服、直肠给药、外敷。,By:,花生,PPTer,吸收入血的药物随血流,转运到各组织器官的过程。,分布,By:,花生,PPTer,药物在体内发生化学结构改变的过程,意义：,1,、利于药物排泄,2,、改变药理活性：,代谢,/,生物转化,By:,花生,PPTer,药物及代谢物从排泄或分泌器官排出体外的过程。,肾脏（主要）肠 肺 皮肤 唾液 乳汁等,排泄,By:,花生,PPTer,时量曲线,反应药物经历转运、转化，血药浓度（量）随着时间（时）的推移而发生变化的动态规律。描述这一规律的曲线,By:,花生,PPTer,仪器分析在中药药理研究中的作用,在传统中药药代学的研究中，,76%,的报道中使用了,HPLC/MS/MS,技术，,24%,使用了,HPLC/ESI-MS,技术。,灵敏，快速，选择性高，效率高,中药的有效成分,中药材,不同药材中同一成分,药代动力学,实验材料及准备,LC-MS/MS,分析,结果分析,By:,花生,PPTer,主要内容,By:,花生,PPTer,液相色谱法串联质谱法同时,测定黄芩素，黄芩甙，木蝴蝶素,A,和汉黄芩素在大鼠血浆中的含量,实验题目,By:,花生,PPTer,本次实验，是利用液相色谱法串联质谱法，快速，准确地测出大鼠血浆中的黄芩素，黄芩甙，木蝴蝶素,A,和汉黄芩素含量，以解释其药代动力学性质。,By:,花生,PPTer,实验背景,是一种多年生草本植物栽培黄芩,inKorea,。这种植物的根在传统的东方医学治疗各种疾病,包括发烧,溃疡、炎症和癌症。含有黄芩各种各样的黄酮,phenylethanoids,、氨基酸、植物固醇和精油。黄芩苷,黄芩甙元,oroxyiln,和汉黄芩素,(,图,1),是黄芩的主要有效成分这些类黄酮具有抗过敏,2,、抗氧化剂,(3,、,4),抗艾滋病毒,(5,、,6),抗炎,7,抗肿瘤,(8-10),抗焦虑药,11,12,和,antigenotoxic anti-hepatitis B,病毒活动,13,。,By:,花生,PPTer,实验背景,黄芩是一种多年生草本植物，它的根在传统的东方医学中被用于治疗各种疾病，包括发热，溃疡，炎症和癌症。它含有各类黄酮，氨基酸，植物固醇和精油，其中的主要活性成分是黄芩苷，黄芩甙，木蝴蝶素,A,和汉黄芩素，它们具有抗氧化，抗过敏，抗病毒，抗焦虑等有显著的作用。,By:,花生,PPTer,材料和试剂,黄芩甙元、汉黄芩素和木蝴蝶素的分离我们之前的方法,13,以及他们的纯度是,99.0%,。黄芩苷是从西格玛化工有限公司,(,圣。路易斯,密苏里州,美国,),。,2-(3,、,4-Dimethoxy-phenyl)5,、,7-dihydroxychromen-4,号,(DPDC,纯度为,99.0%,内部标准,),是由东亚药业有限公司,(,龙仁市、韩国,),。甲醇和乙酸乙酯,(,高效液相色谱级,),获得,Burdick&,杰克逊,Inc.(,美国,MI,马斯基根,),和其他化学物质是最高质量的,By:,花生,PPTer,制备校准标准和质量控制样品,分别将,baicalein,baicalin,oroxylin A,wogonin,的原溶液和,DPDC,加入,DMSO,中，,DPDC,的添加量为,1mg/1ml,。,将原溶液用乙腈稀释，得到工作溶液,.,DPDC,溶液（,0.1,微克,/,毫升）由储备的等量溶液经乙腈稀释得到。,所有的已配置好的溶液都在聚丙烯小试管中避光置于,4,下一周。,By:,花生,PPTer,通过将将工作溶液按比例配置，得到含量分别为,5,10,20,50,100,200 and 500 ng/ml,的,baicalein,oroxylin A,wogonin,大鼠血浆标准液和含量分别为,5,10,20,50,100,200,500,1000,2000 and 5000 ng/ml,的,baicalin,大鼠血浆标准液。,通过分别将,25,微升,0.24,2.40,8.00,微克,/ml,工作溶液添加到,475,微升大鼠血浆中，得到,12.0,120,和,400 ng/ml,的,QC,溶液,最后将各配置溶液以,50,微升，分别置于聚丙烯小试管中，并保存于,-20,直到分析开始,。,制备校准标准和质量控制样品,By:,花生,PPTer,样品制备,50,个单位的大鼠血浆和,QC,样品标准混合,10 l 10%,抗坏血酸是一种抗氧化剂,(31,日,),0.05,的,350 l mhydrochloric,酸、,5 l DPDC,乙腈解决方案和,1000 l,在,1.5 ml-polypropylene,乙酸乙酯管的混合物在,13000g centrifuged 5,分钟。有机层是,pipette-transferred,和蒸发使用真空干燥集中器。残留的溶解在,40 l sonicating 3,分钟,50%,的甲醇,centrifuged,。,aliquots(10 l),注入质,/,女士系统。,By:,花生,PPTer,样品制备,取,50,毫升大鼠血浆标准液，并混合以,QC,和,10,微升,10%,抗坏血酸作为抗氧化剂。再加入,350,微升,0.05M,盐酸，,5,微升,DPDC,于乙腈溶液中，并加入,1000,微升乙酸乙酯于,1.5ml,的聚丙烯小管中。混合物离心（,13000 xg,）,5,分钟。分离有机层并干燥。溶解残渣于,40,微升,50%,甲醇并静置,3,分钟，再度离心。取上清液,10,微升加入,LC-MS/ms,系统。,药代动力学,实验材料及准备,LC-MS/MS,分析,结果分析,By:,花生,PPTer,主要内容,By:,花生,PPTer,简介,色谱质谱的在线联用,将色谱的分离能力与质谱的定性定量功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。,安捷伦液相色谱,/,离子阱质谱系统,在线真空脱气机,二元或四元梯度液相泵,自动进样器,柱温箱,二极管阵列检测器,By:,花生,PPTer,（分离、定量和定性）,黄芩苷，千层纸素A和汉黄芩素，大鼠血浆中黄芩活性成分的测定。,经过液液萃取与2-（3,4-二甲氧基-苯基）-5,7-二羟基-色烯-4-酮作为,内标物,，黄芩素，黄芩，千层纸素A和汉黄芩素是从一个洗脱色谱柱C18于7分钟，由甲醇和0.1甲酸的等度流动相柱（60:40，V/V）,。,被检测的分析物使用电喷雾电离串联质谱在多反应监测（MRM）模式。,By:,花生,PPTer,LC-MS/MS分析,色谱系统由NANOSPACE的,SI-2泵（,高压输液泵,），SI-2,自动进样器,和一个S-MC,系统控制器,，,固定相,C18柱（5微米，2.1mm内径100mm），,流动相,使用甲醇的混合物中，,并0.1甲酸（60:40，V/V），,流速,0.2毫升/分钟，色谱柱和自动进样器托盘,温度,分别为50C和4C，,时间为7.0分钟，,洗脱液被直接引入串联的正电离电喷雾源四极杆质谱仪。,ESI是近年来出现的一种新的电离方式。它主要应用于液相色谱-质谱联用仪。它既作为液相色谱和质谱仪之间的接口装置，同时又是电离装置。它的主要部件是一个多层套管组成的电喷雾喷嘴。最内层是液相色谱流出物，外层是喷射气，喷射气常采用大流量的氮气，其作用是使喷出的液体容易分散成微滴。另外，在喷嘴的斜前方还有一个补助气喷嘴，补助气的作用是使微滴的溶剂快速蒸发。在微滴蒸发过程中表面电荷密度逐渐增大，当增大到某个临界值时，离子就可以从表面蒸发出来。离子产生后，借助于喷嘴与锥孔之间的电压，穿过取样孔进入分析器。,加到喷嘴上的电压可以是正，也可以是负。通过调节极性，可以得到正或负离子的质谱。产物离子被转换为采用量化。,By:,花生,PPTer,锥电压,分别为35V的黄芩素，33V的千层纸素A和汉黄芩素28V的黄芩苷和55V的DPDC。（？）Multiplereaction-,监测（MRM）模式下使用的特定前体/产物离子被转换为采用,量化,。,药代动力学,实验材料及准备,LC-MS/MS,分析,结果分析,By:,花生,PPTer,主要内容,baicalein,oroxylin A,wogonin and DPDC,（三种待测物与内参物）的电喷雾电离产生丰富的质子化分子离子（,MH+,）为质荷比（,m/z,）：,271.2,，,285.3,，,285.3,和,315.0,，,这些碎片离子被生产作为突出的产品离子分别是：黄芩素,M/Z 123,（三羟基苯基部分），,M/Z 271,（黄芩,MH+,离子损失葡萄糖醛酸部分），,M/Z 270,汉黄芩素（,MH+,离子损失甲基），对于,M/Z 270,（,MH+,离子损失甲基基团）千层纸素,A,和,M/Z 299,（,MH+,离子损失甲基基团）为,DPDC,。,By:,花生,PPTer,用该色谱法分离黄芩素，黄芩苷，千层纸素,A,和汉黄芩素的保留时间是约,4.36,，,2.59,，,5.17,和,6.17,分钟，良好的分辨这四个类黄酮。,校准曲线是通过浓缩，得到黄芩素，千层纸素,A,和汉黄芩素范围和黄芩苷浓度为,5.0-5000,纳克,/,毫升的大鼠血浆。对于低,CV,值（,CV=,方差,/,均值）黄芩素（,3.6,），黄芩（,5.7,）的斜坡上，千层纸素,A,（,2.6,）和汉黄芩素（,3.0,）所表示的方法的可重复性（表,1,）。,服务管理,Service management,By:,花生,PPTer,批内和批间,CV,值分别为：黄芩素,0.8-6.1,，千层纸素为一,1.7-5.2,，汉黄芩素,1.4-5.9,，黄芩苷,1.6-4.1,。日内和批间的,RE,值为,-4.0,至,4.2,的黄芩素（,baicalein,），,-1.3,至,1.7,千层纸素,A,（,oroxylin A,）和,-3.8-5.8,汉黄芩素（,wogonin,），,-1.7-1.7,黄芩苷（,baicalin,）。这些结果表明本方法具有可接受的准确性和精确度。,(,如,Table 2),服务管理,Service management,By:,花生,PPTer,提取回收黄芩素，黄芩苷，千层纸素,A,和汉黄芩素的加标大鼠血浆测定采用一步法液,-,液萃取，用乙酸乙酯在酸性,pH,浓度为,15.0,，,75.0,和在,400,纳克,/,毫升重复六次。回收率分别为黄芩素,82.8-87.1,，黄芩苷和,71.1-76.9,，千层纸素为一,81.5-83.2,汉黄芩素为,81.4-84.7,（表,3,）。,DPDC