分子生物学基本技术 —PCR (Polymerase Chain Reaction)

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学基本技术 PCR,(,P,olymerase,C,hain,R,eaction),PCR,(,P,olymerase,C,hain,R,eaction),一、历史及其发展,二、PCR的基本原理,三、Primer design引物常规设计原则,四、PCR反应体系,五、PCR反应条件优化（PCR optimization),六、PCR反应特点,七、PCR产物的分析,八、Molecular marker,九、PCR技术的应用,分子生物学技术体系,基本技术,基因及产物 分子检测技术,基因及产物 获取技术,基因 功能研究技术,基本技术,1.琼脂糖凝胶电泳,2.SDS-PAGE 电泳,3.PCR技术,4.细菌转化,聚合酶链式反应-,PCR,(,P,olymerase,C,hain,R,eaction),一、历史及其发展：,1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。,但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了,1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）,基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制,最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错,耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪,1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。,1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。,1993年：Mullis与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家Michael Smith共获诺贝尔化学奖,Kary Mullis&Michael Smith,穆利斯（Kary Mullis）,美国化学家,1944,史密斯（Michael Smith）,加拿大化学家,1932,二、PCR的基本原理,PCR的基本原理：,变性、复性、半保留复制,PCR三步曲 Three steps：,Denaturation,变性 9097,Primer annealing,退火 4555,Polymerization,延伸 72,原 理,类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热,变性,解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生,退火,，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以,延伸,。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,回忆：,DNA 的复制,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,解旋酶,解链酶,回忆：DNA 的复制,RNA引物,RNA引物,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,引物酶,引物酶,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,回忆：DNA 的复制,ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,5,3,TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG,3,5,DNA,解旋解链,合成引物,子链延长,TAGCGCTATCGCATCGACGCT,3,ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC,3,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,回忆：DNA 的复制,PCR简要过程图解,PCR详细过程图解,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（min）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复13步,2530轮,目的DNA片段,扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链,与引物复性,DNA变性,形成2条单链,子链延伸,DNA加倍,模板DNA,95,1,50,引物1,引物2,DNA引物,2,引物1,引物2,DNA引物,72,Taq酶,Taq酶,3,第1轮结束,95,第2轮开始,4,72,Taq,Taq,Taq,Taq,5,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,三、,Primer design,引物常规设计原则,1.长度：15-37 nt,一般20nt左右;(仅binding,不含接头),2.G+C 含量4060，而且四种碱基的分布最好随机。,3.避免聚嘌呤或聚嘧啶或有回文对称结构；,4.引物自身不能互补（3个）,5.引物之间不能互补（5个）,6.引物端不能错配,不能修饰，尽量不用T,不能超过个连续的G或C；,7.端可变化修饰，附加酶切位点；,8.两引物的Tm值应比较接近；,9.正链引物：mRNA序列照抄；,负链引物：先写出mRNA序列的互补序列，然后翻转重写。,10解链温度,Tm=4(G+C)+2(A+T)=20nt,Tm一般最佳,PCR反应中结合温度（anneaning temperature）T=Tm-5,P+、P-的设计方法,四、PCR反应体系,标准的PCR反应体系：,10扩增缓冲液 10ul4种dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至 100ul,Template,（模板）：,ssDNA,dsDNA,mRNA needed to be RT as cDNA模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一。,Primes,（引物）：,每条引物的浓度0.11umol或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，增加二聚体的机会。纯化引物在25乙腈溶液中4；冻干引物于-20可保存1-2年，液体状态于-20可保存6个月。不用时应-20保存。,dNTPs：,dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。,Mg,2+,：,for Taq polymerase activity,Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。,Buffer：,10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8,20)。,Taq DNA polymerase,（Taq DNA 聚合酶）：,浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。,分离:,1969年，美国黄石国家公园温泉,分子量:,94KDa,活性：,在几种水生栖热菌中活性最高，200 000U/mg,离子需要：,对Mg2+、单价离子性质和浓度较敏感。最适浓度50mmol/L。,忠实性:,没有校正单核苷酸错配功能-致命弱点。一般出错率为210-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。,Taq,DNA聚合酶,酶活性(%),40 50 60 70 80 90 100,100,80,60,40,20,五、PCR反应条件优化（,PCR optimization,),1、变性温度和时间,一般情况下，9295 l-5min足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。,2、退火(复性)温度与时间,引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时，应提高温度。温度越高，产物特异性越高。通常37-55、1-2分钟。,变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。,退火温度与时间，,取决于,引物的长度,、,碱基组,成及其,浓度,，还有,靶基序列的长度,。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：,Tm,值(解链温度)=,4(G+C)2(A+T),复性温度,=Tm值-(510),3、延伸温度和时间,温度,：72，接近Taq酶的最适75，高于90时，DNA合成几乎不能进行,Taq DNA聚合酶的生物学活性,：7080 150核苷酸/S/酶分子70 60核苷酸/S/酶分子55 24核苷酸/S/酶分子,时间,：过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。一般：,1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的,34kb的靶序列需34min,10Kb需延伸至15min。,延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。,4、循环次数,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环过多，非特异性产物大量增加，循环次数决定PCR扩增程度。,六、PCR反应特点,1.特异性强：,引物与模板DNA特异正确的结合；碱基配对原则；Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；靶基因的特异性与保守性。,2.灵敏度高：,PCR产物的生成量以指数方式增加,3.简便、快速：,PCR反应一般在24 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广,。,4.对标本的纯度要求低：,DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。,七、PCR产物的分析,1、凝胶电泳分析,通常应用12%的琼脂糖凝胶，供检测用。聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中。,2、PCR产物电泳,EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。目前可用,SYBR,的新型,荧光染料,来替代EB，从而减少了对环境的污染，并可有效保护实验操作者。,3、酶切分析,根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。,4、分子杂交,分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。,在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状。,5、核酸序列分析,是检测PCR产物特异性的最可靠方法。,八、Molecular marker,1、传统水平,：,形态标记、细胞学标记、生化标记,2、分子水平：,第一类,：电泳、分子杂交为核心,代表,：RFLP,第二类,：电泳、PCR为核心,代表,：RAPD、SSR、AFLP,第三类：,DNA序列为核心,代表：,单碱基多态性（SNP），DNA序列的单个核苷酸的差别,3、应用,种质资源研究,品质纯度鉴定（包括DNA指纹鉴定）,构建遗传连锁图,基因定位（QTL）,标记辅助选择,比较基因