血清谷丙转氨酶活性的测定

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,赖氏法测定血清谷丙转氨酶活性,(ALT),的测定,【,目的要求,】,1.,掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。,2.,熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作方法。,3.,了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。,【,实验原理,】,ALT催化丙氨酸与-酮戊二酸之间的氨基转移,生成丙酮酸和谷氨酸,在37,pH7.4,经30min反应之后，加入2,4-二硝基苯肼终止反应,并与反应中的二种-酮酸生成2,4-二硝基苯腙,在碱性条件下显,红棕色,于波长505nm处读取A值。,两种苯腙的吸收光谱曲线在500520nm处差异最大,丙酮酸苯腙的呈色强度是-酮戊二酸苯腙的3倍,据此可以计算出丙酮酸的生成量,后者与血清中的ALT的活性浓度成正比。,【,实验原理,】,丙氨酸,+,-,酮戊二酸,丙酮酸,+,谷氨酸,ALT,2,4-,二硝基苯肼,-,酮戊二酸,-2,4-,二硝基苯腙,丙酮酸,-2,4-,二硝基苯腙,0.4mol/LNaOH,红棕色,红棕色,（三倍）,卡门单位,:,1ml,血清在,25,340nm,体积为,3ml,光径为,1cm,每分钟光密度下降,0.001,的酶量。,1,、主要器具,微量移液器,【,实验仪器,】,可见分光光度计,【,实验试剂,】,1,0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）,2,基质缓冲液,精确称取D-L-丙氨酸1.79g,-酮戊二酸29.2mg,先溶于0.1mol/L磷酸盐缓冲液约50ml中,用1mol/L NaOH调pH至7.4,再加磷酸盐缓冲液至100ml,每升底物缓冲液中可加氯仿防腐,4保存。,3,1.0mmol/L 2，4-二硝基苯肼溶液,4,0.4mol/L NaOH溶液,5,2.0mmol/L丙酮酸标准液,6,待测标本,:,病人血清或质控血清。,【,操作步骤,】,（,1,）待测血清的测定,加入物,(ml),对照管,测定管,血清,0.1,0.1,基质缓冲液,0.5,混匀，37水浴,3,0min,2,，,4-,二硝基苯肼溶液,0.5,0.5,基质缓冲液,0.5,混匀，37保温,2,0min,0.4mol/L NaOH,溶液,5.0,5.0,混匀，室温放置,5min,，在波长为,505nm,处比色，,蒸馏水调“,0”,【,操作步骤,】,（2）校正曲线的制备,加入物,(ml),0,1,2,3,4,0.1mol/L,磷酸盐缓冲液,0.1,0.1,0.1,0.1,0.1,2.0mmol/L,丙酮酸标准液,0,0.05,0.10,0.15,0.20,基质缓冲液,0.50,0.45,0.40,0.35,0.30,1.0mmol/L 2,，,4-,二硝基苯肼溶液,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,混匀，37保温,2,0min,0.4mol/L NaOH,溶液,5.0,5.0,5.0,5.0,5.0,卡门单位,0,28,57,97,150,混匀，室温放置,5min,，在波长为,505nm,处比色，,蒸馏水调“,0”,取,7,支试管，按下表操作,卡门单位,0,28,57,97,150,加入物,(ml),对照管,测定管,0,1,2,3,4,血清,0.1,0.1,基质缓冲液,0.5,混匀，37水浴,3,0min,0.1mol/L,磷酸盐缓冲液,0.1,0.1,0.1,0.1,0.1,2.0mmol/L,丙酮酸标准液,0,0.05,0.10,0.15,0.20,基质缓冲液,0.50,0.45,0.40,0.35,0.30,1.0mmol/L 2,，,4-,二硝基苯肼溶液,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,基质缓冲液,0.5,混匀，37保温,2,0min,0.4mol/L NaOH,溶液,5.0,5.0,5.0,5.0,5.0,5.0,5.0,混匀，室温放置,5min,，在波长为,505nm,处比色，,蒸馏水调“,0”,【,实验结果,】,1.校正曲线的制备,以,标准管,各管的A值-,“,0,”号,管的A值,所得差值与对应酶卡门氏单位作图,即成校正曲线。,2.测定管,测定管A值-对照管A值,根据,所得差值，从校正曲线查得标本中,ALT的卡门氏单位。,参考值范围：,5-25,卡门单位,【,注意事项,】,1.,血清和底物应于,37,水浴后操作,最好置,37,水浴箱中操作。以一定时间加入，各管即时混匀,以第一管开始计时,准确反应,30,分钟,各管加入时间间隔一致,保证每管反应时间均为,30,分钟。,2.,加入,2,4-,二硝基苯肼溶液后,应充分混匀,使反应完全。,3.,加入,NaOH,溶液的方法和速度要一致,如液体混合不完全或加入速度不同均会导致吸光度的差异。,4.,底物和显色剂均为呈色物质,称量必须很准确。,5.,呈色的深浅与,NaOH,的浓度也有关系,其浓度越大呈色越深,但其浓度,0.25M,时,吸光度下降变陡,因此浓度要准确。,【方法,学,评价】,1.,重复性差,1),由于,限制了-酮戊二酸的用量,。使生成量与酶活性不能呈现良好的线性关系。,2),2,4-二硝基苯肼在碱性条件下也能显色,为了降低试剂空白的吸光度而不得不使用,低浓度的2,4-二硝基苯肼,此种水平的苯肼仅能与反应体系中的两种酮酸的一半反应。,3),产物旁路效应：丙酮酸在LDH的催化作用下的消耗。,【方法,学,评价】,2.,准确性差,：线性范围狭窄,尽管标本采用稀释后测定,但偏差仍较大。,3.,试剂稳定性差,4.,操作简单,【临床意义】,肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细胞受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清中ALT活性增高。,测定ALT是检查肝功能的重要指标之一,。,1.ALT显著增高见于各种急性肝炎及药物中毒性肝细胞坏死。,2.中等程度增高见于肝癌、肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞。,3.轻度增高则见于阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发性肌炎亦可引起转氨酶活性升高。,