实验核医学(第四章)课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 放射性核素标记化合物,第一节 基本概念,1.,放射性浓度单位体积溶液中含有的放射性活度，,Bq,/L,、,Bq,/ml,。,2.,放射化学纯度放射性标记化合物的放射性活度占该样品的总放射性活度的百分比。,3.,放射性比活度单位质量放射性物质的放射性比活度。重要参数，根据实验设计要求。,4.同位素标记各种化合物上的元素被该种元素的放射性同位素所取代的标记。,5.非同位素标记利用性质接近的放射性核素代替需标记化合物上的元素的标记。,6.定位标记把放射性核素标记到化合物指定位置上的标记。,7.非定位标记无法确定放射性核素标记到化合,物上的某部位的标记。,全标记（一般标记）标记化合物上原子被取代的机会均等的标记。,准定位标记在定位标记时，由于中间过程，可能也标记在其它位置上的标记。,第二节 标记化合物的制备,一、放射性核素的选择,1.,基本不改变原有化合物的物理化学性质；,2.,标记核素与化合物的结合牢固、稳定性好；,3.,合适的半衰期；,4.,射线容易测量；,5.,其它，标记难易、价格、防护等。,二、考虑因素,1.原材料及其价格；,2.标记物的稳定性；,3.微量操作技术；,4.冷试验；,5.防护措施及防污染、废物处理方案。,三、基本方法,1.同位素交换法：某一放射性核素或其化合物与待标记化合物中相同元素的非放射性核素进行交换反应。,2.化学合成法：应用放射性核素的原原料，通过各种化学反应，将放射性核素合成到待标记化合物的特定位置上。,3.生物合成法：全生物合成,利用生物的生理代谢作用，将简单的放射性原料转化成所需的标记物；,酶促合成利用酶的生物活性，将放射性前体转变为所需的标记物。,4.络合物/鳌合物生成法：将放射性金属离子和具有特定功能的化合物进行络合或鳌合反应。利用了金属离子易生成络合物或鳌合物的原理。,第三节 常用标记化合物的制备,C,、,H,生命物质的主要组分，生命科学中常用,14,C,、,3,H,来标记所需化合物。,125,I,性质活泼，易与蛋白质和多肽发生取代反应，且发射的,射线易测量。,P,、,S,核酸、蛋白质的组成元素，,32,P,、,33,P,、,35,S,在,DNA,测序等,分子生物学中广泛应用。,一、,14,C,标记化合物的制备,C,的主要同位素,14,C,的特点：,1.,半衰期长；,2.,发射的,-,射线能量低，可用液闪测量，易防护；,3.,用于自显影，影像清晰；,4.,14,C,的化合物较稳定，辐射自分解速度慢。,核素,半衰期,衰变方式,射线能量(MeV),天然丰度,生产核反应,11,C,20.38分,+,0.9608,11,B(p,n),12,C,稳定,98.892,13,C,稳定,1.108,14,C,5730年,-,0.155,14,N(n,p),（一）,14,C标记化合物的化学合成,起始原料：Ba,14,CO,3,或,14,CO,2,中间体：由原料经一步或两步反应制得简单,14,C标记物,例1：制备,14,C标记的维生素K,2,例2：1-,14,C-乙酸的制备,方法1：,方法2：,核素标记的位置一般根据实验目的而选择。,例,3,：,例,4,：,-,14,C-,丝氨酸,14,C-,甲酸 甘氨酸,化学合成法的优点：,能定位标记；,纯化较容易；,放射性比活度高。,缺点：,需特定的原料或中间体；,需特殊的微量操作和射线防护技术；,合成步骤较多，对复杂化合物的标记有困难。,（二）,14,C标记化合物的生物合成,1.全生物合成,采用一些低等生物，如细菌、绿藻、酵母等，利用它们的代谢活泼，繁殖迅速，可把简单的放射性原料（如,14,CO,2,）掺入到细胞内，再进一步处理得到所需标记物。,特点：,方法简单；,可制得结构复杂化合物；,保留化合物天然生物活性和天然构型。,缺点：,无法控制定位；,分离纯化较难；,标记率较低,。,2.酶促合成,利用特定的酶，通过一步或几步反应，将标记前身物转化为所需的标记产物。,2-,14,C-胸腺嘧啶 尿嘧啶核苷 2-,14,C-胸腺嘧啶核苷 尿嘧啶,特点：,定位标记，可得生物活性、光学构型的标记物,缺点：,需有相应的前体和合适的酶,二、氚标记化合物的制备,氢的同位素,优点：,1.来源丰富，测量简便；,2.能量弱，射程短，无需特别防护；,3.可获高分辨率自显影效果，可观察亚细胞形态；,4.制备较简单，可获高比活度产物，灵敏度高；,5.半衰期长，易运输、贮存、安排实验。,核素,半衰期,射线及能量(keV),天然丰度,生产核反应,1,H(H)氕,稳定,99.9852,2,H(D)氘,稳定,0.0148,3,H(T)氚,12.33年,-,，,18.6,14,N(n,p),缺点,：,1.,3,H在分子中易丢失；,2.高比活度产物易发生辐射自分解；,3.标记物与非标记物质量相差大，标记位置可能会影响反应速率。,同位素效应：因同位素的原子质量不同而引起反应速率改变的现象。,标记位置远离反应部位，可减少同位素效应。,常用标记方法：,同位素交换法,化学合成法,生物合成法,（,一）同位素交换法,RH+T,2,RT+HT,操作简单，但氚常标在不稳定位置，难于定位，产品比活度低，较难纯化。,1.氚气曝射交换法：,将待标记物均匀途布在反应容器中，减压真空，通入纯氚气，密闭反应数日数周，回收氚气，纯化标记物。一般适用于结构复杂化合物（中药有效成分）的标记。,提高比活度，缩短反应时间：,活化氚气，将氚分子解离为氚原子或氚离子；,尽可能分散待标记样品，扩大反应接触面；,加入催化剂，如钯黑或铂黑。,缺点：不定位；,氚的利用率低；,易导致待标记物化学键断裂；,分离纯化较难。,2.溶液中的催化交换法,（1）,均相催化交换法,氚化溶液：氚水、,3,H-醋酸,催化剂：多为酸性试剂乙酸、三氯乙酸、硫酸、磷酸、过氯酸、氯化铝等；,一般需加热数小时数十小时。,（2）非均相催化交换法,快速、简便,氚化溶液中的非均相交换,操作简便，反应时间短，杂质少，不饱和键一般不发生加氚反应；但标记位置难以预定，不适用热不稳定化合物。,氚气在溶液中的非均相催化交换法,可获得高纯度、高比活度标记物，适用于苄基化合物、雌激素、嘌呤核苷、嘌呤核苷酸及糖的标记，不适用于不饱和键化合物、卤代化合物的标记，标记位置不确定。,（二）化学合成法,是目前制备高比活度的定位标记的最成熟、最重要的方法。,合适的前体：烯烃、炔烃、有机卤化物、腈、羧基化合物。,还原剂：氚气，氚化金属（NaBT,4,、LiBT,4,、KBT,4,、LiAlT,4,）,方法：催化加氚法、催化卤氚置换法、氚化金属还原法。,1.催化加氚法,适用于含不饱和键前体的标记，及嘌呤类核苷酸、核苷酸、激素等标记，对还原糖可定位标记在醛基上，对含苄基的化合物，可定位在亚甲基上。,2.催化卤素置换法,一般还在反应中加入有机胺类的添加剂，可中和反应产物卤化氢,（,3,HX），,利于反应进行。,简便，可定位标记，产物比活度较高，但需合适的卤化物前体。,注意事项：,催化剂的使用：铂、钯及其氧化物。钯更好。提高催化效率，可加用活性炭、BaSO,4,、CaCO,3,等载体，增加有效表面活性，5、10 Pd/C。,若氚水浓度高，辐射自分解重，需稀释；氚气无此问题，需专门真空系统中操作。,一般会产生放射化学杂质，需纯化处理。,3.氚化金属还原法,用氚化金属(NaB,3,H,4,、LiB,3,H,4,、KB,3,H,4,、LiAl,3,H,4,)选择性地将羧酸、酯、酮、醛、腈类化合物还原成相应的醇类、胺类。定位标记。把氚加成到不饱和键的碳原子上。,（三）生物合成法,以氚的标记物为底物，利用专一性很强的酶为催化剂，将该标记物转化为另一所需的标记物。,标记物一般可定位标记，且保留生物活性。,如,3,H-TdR,的制备：,甲基-,3,H胸腺嘧啶 尿嘧啶核苷 甲基-,3,H胸腺嘧啶核苷 尿嘧啶,三、放射性碘标记物的制备,常用的放射性碘同位素,核素,半衰期,射线及能量,(MeV)(%),主要生产方式,123,I,13.06h,EC,：,E,0.159,，,85,121,Sb(,，,2n),E,0.564,，,18,125,I,60d,EC,：,E,0.0335,，,6.7,124,Xe(n,),125,Xe(EC),E,0.027,，,119,E,0.031,，,26,127,I,稳定,无辐射,天然丰度100,131,I,8.04d,-,：,E,0.336,，,13,130,Te(n,),131,Te(,-,),E,0.607,，,86,EC,：,E,0.364,，,81,E,0.637,，,7.2,特点：,化学性质活泼，标记技术易掌握；,所需设备简单,特别适用于蛋白质、多肽的碘标记；,半衰期适中，易于商品化、贮存、废物处理；,发射低能,射线，易测量；,辐射自分解较小，标记物较稳定；,比活度较高，灵敏度高。,（一）同位素交换法,RI+Na*I,R*I+NaI,方法简单，产物易纯化，可得较高比活度的标记物，但须合适的前体，及特定的条件（温度、压力、酸碱度）。,碘-溴交换法，可得高比活度、高纯度产物。,（二）蛋白质、多肽的碘标记技术,前提：,1.待标记物要有易被碘原子结合或取代的基团（酪氨酸、组氨酸、色氨酸）；,2.必须先把,125,I,-,氧化成,125,I,2,。,酪氨酸 组氨酸 色氨酸,影响碘化反应因素,：,1.,可结合基团数量，及暴露程度；,2.,氧化剂性质、反应条件,(pH,、浓度、温度、反应时间,),。,一般来说，在保证一定标记率得前提下，尽可能减少氧化物得用量，以保证标记物得生物活性和免疫活性。,碘化反应种类,：,1.,氯胺,-T,法：,方法简便，标记率高，重复性好，试剂易得，是迄今最常用方法之一。,Cl,-T,（,N-,氯代对甲苯磺酰胺钠盐）：性质温和，在水溶液中水解产生次氯酸，次氯酸氧化碘离子成碘分子。,注意事项：,氧化剂,Cl,-T,不稳定，临用时配置；,用量适当；,反应完需用等量的还原剂偏重亚硫酸钠（,Na,2,S,2,O,5,),中和,临用时配置；,pH,在,7,8,，常用,0.2,0.5M,磷酸缓冲液；,反应体积适当，,50,300,l,；,温度和时间，室温,1,3min,，若,4,，增加时间；,不适用于生物活性不稳定物质，如一些补体、某些激素、酶、受体等。,2.,乳过氧化物酶法（,LPO,）：,过氧化物酶作用于,H,2,O,2,，放出新生态氧，氧化,125,I,-,为碘分子。常用乳过氧化物酶。,注意事项：,用量少，为待标记蛋白的,1,；,pH,范围较宽，,4,8.5,；,H,2,O,2,用量少；,反应时间,30,60min,也能用于各种脂肪、细胞、细胞膜的标记；,过氧化物酶来源困难，标记率低；,酶本身也可能被标记而产生杂质。,3.,固相氧化法：,将氧化物或过氧化物酶以固体的形式，或制成固体颗粒，进行液,-,固氧化反应。,目前常用,Iodogen,法。,Iodogen,：,1,3,4,6-,四氯,3,6,-,二苯,-,甘脲，氧化剂，与,Cl,-T,同属氯酰胺类。,注意事项：,Iodogen,不溶于水，可用二氯甲烷溶解；,制备,Iodogen,涂管（,5,25,g/,管），封口冷藏；,无需配置氧化剂、还原剂,将反应液倒出或稀释，即终止反应；,对标记物损伤程度小，标记率较高。,4.,联接标记法：,间接标记法。先将放射性碘标记到较活泼试剂上，再联接到待标记化合物上。,常用,Bolton-Hunter,试剂，,3-(,对,-,羟基苯,),丙酸,-N-,琥珀亚胺酯（,HPNS,）。,步骤：,125,I,标记,HPNS,；,125,I-HPNS,上的酰基与蛋白质或多肽上的游离氨基发生缩合反应。,可避免蛋白质与氧化剂直接接触，防止生物活性损伤；对于在体内不稳定的酪氨酸残基碘标记物，提供一种选择。,较麻烦，引入一较大基团会影响示踪性质。,四、,32,P,、,33,P,和,35,S,标记化合物的制备,32,P,：射线能量较强