ELISA的技术要点及质量管理

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,ELISA技术要点及质量管理,11/27/2024,一、概述,1、定义,ELISA是英文Enzyme Linked Immunosorbent Assay 的简写，称为酶联免疫吸附试验法。最早于上世纪70年代，由瑞典学者,Engvall及Perlman,等报道。,2.基本原理,（1）抗原或抗体以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；,（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；,（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成比例，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。,3.基本方法,根据检测目的和操作步骤不同分为三种基本方法,双抗夹心法,间接法,竞争法,其他：捕获法，生物素亲和素ELISA等,双抗夹心法 检测抗原（体）的常见方法，应用针对抗原两个不同决定族的两种单抗分别作为固相载体和酶标抗体，检测溶液中的抗原（适用于二价以上抗原）。,间接法 检测抗体的方法，利用酶标记的抗抗体（第二抗体）检测已与固相抗原结合的抗体。,竞争法 检测抗原或小分子半抗原、抗体，以测抗原为例，使待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，结果如待测抗原含量越多，与固相抗体结合的酶标抗原就越少，显色越浅，二者呈负相关。,二、临床应用,1、可用于检测的样本,可用作ELISA的标本十分广泛，体液（如血清，血浆，各种积液），分泌物（如唾液）和排泻物（如粪便，尿液）均可作为标本以测定其中的抗原或抗体成分，一般使用血清。,2、ELISA临床应用,应用于多种病原微生物所引起的传染病的诊断。,人体某些血浆蛋白质的检测,肿瘤标志物的检测,人体激素和某些酶类物质的检测,某些药物和毒品的定量测定,三、ELISA技术要点,ELISA的基本操作流程,加样,温育,洗涤,显色,判读,加样,加样应用微量移液器（加样枪)按规定的量加入微孔板的1/3处避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。,每次加样应更换吸嘴，做到一人一吸头，以免发生交叉污染;干吸头预先在血清中抽吸三次。,样本稀释，目的是为了减少非特异性反应，所以一定要先加稀释液后加样本，且需振荡混匀。,温育,抗原抗体反应需要在一定温度（37），经过一定的时间才能达到反应的平衡点,一般采用能使反应液温度迅速达到平衡的水浴法。一种放在水浴箱的隔板上，另一种是放在温箱的湿盒里。水要浸至板条的1/3处，不可将板条叠加放置。,洗涤,ELISA是靠洗涤来达到分离结合与未结合抗原抗体复合物及酶标记物的目的，同时洗涤也可将非特异吸附的蛋白质的干扰以及血球、细菌中的酶干扰清除掉。,手工法洗涤,1）甩去孔内反应液；,2）用洗涤液过洗一遍（即注满孔后即甩去）；,3）微孔重新注满洗液后浸泡2-3分钟，间歇摇动；,4）甩去孔内液体，拍板，用纸吸干。,重复以上操作至少3次。注意各种试剂盒的洗涤液尽量不要混用。,洗板机洗板,板架要放平整,洗板机上的每个放液和吸液纤孔都能一致地插入孔底，将孔内液体全部吸干,同时要设置一定的浸泡时间。,显色,HRP催化底物的一步呈色反应，需要一定的时间和温度，,一定要按照说明书规定的时间温度（一般为37C，10-15分钟）恒定反应后终止,酶标仪判读结果,常见的显色系统有OPD和TMB二种，以后者最为常见，而TMB酸不易终止因此必须尽快比色以免影响结果。OPD终止后显棕色，测定波长为490nm；,TMB终止后显黄色，测定波长为450nm，,二种底物的校正波长均用630nm。,使用双波长的优点可以消除反应板条上的划痕手印的干扰。同时要注意反应板应用纸吸干后才能置酶标仪中比色，否则吸光度易出现负值或损坏滤光片。,报告方式,定性试验 国内外为便于统一计算，一律按S/C.O方式报告，S为标本A值，C.O即Cut Off值（阳性判定值),夹心法和间接法以S/C.O1为阳性；,竟争法与中和法以S/C.O1为阳性,报告方式,定量分析 用已知量的标准品作一系列稀释，ELISA测定，绘制标准曲线，结果以绝对量或单位表示。,ELISA的标准曲线每次都要和待测标本做在同一块板上。,因此严禁用定性试剂盒做定量分析。,四、质量管理,合格的样本、试剂以及人员是完成ELISA试验的基本要求，仪器的正常运行是ELISA试验的必备条件，规范化的操作和全面的质量控制是完成ELISA的质量保证。,人员要求,检验项目的基本原理（ELISA原理）；临床意义；熟悉检测技巧，了解易出差错的环节及难点；熟悉检测试剂性能（包括试剂盒组成，包被片段及其组成）；熟悉检测仪器的原理及性能；掌握数据处理的能力和质量控制知识。,样本要求,采样时应尽量避免溶血，避免细菌污染,尽量不用抗凝血,避免样本间交叉污染,标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合，使间接法的试剂本底加深，一般血清置4冰箱5天内完成测试。,试剂要求,试剂评价指标有灵敏度，特异性，精密度，稳定性，简便性，安全性及经济性作出全面的评价。,根据权威部门发布的试剂评价结果，了解市场上试剂的质量优劣。,仪器质控,移液器：ELISA加样量小（5-100l），一般误差应在10%以内，定期校准,水浴箱 经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有1的误差；,洗板机 每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定一般不超过2ul，人工扣板时，垫纸不湿，定期检查管孔是否堵塞；,酶标仪 经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正,操作要求,建立标准操作程序,加样、温育、洗涤、显色、结果判读每一步骤都参照技术要点的要求进行。,质量控制,定性试验,建议使用临界值血清界定法：将试剂盒所设的阴阳性对照作为内对照指示反应；另设临界值、高值质控血清，正常人血清作为外对照，与标本同时检测，临界值S/C.O1，高值质控血清S/C.O10，正常人血清A值在0.050.07之间。,阳性质控血清失控应重做阴性标本,阴性对照失控应重做阳性标本,质量控制,定量试验：参照生化检验质量控制。,灰区概念,把定量分析的正常值范围引入定性分析建立灰区概念，即将CO值上下的一段区域定为阳性可疑，需重复实验或换试剂重测以确定其阴阳性，如仍落在灰区范围内则报告+（阳性）。,阴性,C.O.,阳性,灰区,灰区的设置有二种：,1）C.O（1CV）CV为该试剂的批内CV（一般在15-20%间）；,2）C.O2s，s为实验室做室内质控ROC的s。,高值钩状效应,在二位点夹心ELISA中，由于样本中抗原浓度过高，过量的抗原分别与固相抗体及酶标抗体结合，而不在形成夹心复合物，致所得结果低于实际含量，甚至出现假阴性结果,。,抗原,吸光度,谢谢！,内容总结,ELISA技术要点及质量管理。5/27/2022。（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。应用于多种病原微生物所引起的传染病的诊断。一种放在水浴箱的隔板上，另一种是放在温箱的湿盒里。水要浸至板条的1/3处，不可将板条叠加放置。2）用洗涤液过洗一遍（即注满孔后即甩去）。3）微孔重新注满洗液后浸泡2-3分钟，间歇摇动。常见的显色系统有OPD和TMB二种，以后者最为常见，而TMB酸不易终止因此必须尽快比色以免影响结果。使用双波长的优点可以消除反应板条上的划痕手印的干扰。标本在冰箱中保存时间过长易导致血清IgG聚合，使间接法的试剂本底加深，一般血清置4冰箱5天内完成测试。移液器：ELISA加样量小（5-100l），一般误差应在10%以内，定期校准。水浴箱 经常检查水浴箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有1的误差。C.O.。谢谢,