十六蛋白质工程和基因工程的简介

第,十,十,六,六,章,章,基,基,因,因,工,工,程,程,和,和,蛋,蛋,白,白,质,质,工,工,程,程,简,简,介,介,第,一,一,节,节DNA重,组,组与,基,基因,工,工程,第二,节,节蛋白,质,质工,程,程简,介,介,第三,节,节核酸,研,研究,技,技术,简,简介,返回,第一,节,节,DNA,重组,和,和基,因,因工,程,程,基因,工,工程,亦,亦称,遗,遗传,工,工程,，,，即,利,利用DNA重,组,组技,术,术的,方,方法,，,，把DNA作,为,为组,件,件，,在,在细,胞,胞外,将,将一,种,种外,源,源DNA,（,（目,的,的基,因,因）,和,和载,体,体DNA,重,重新,组,组合,连,连接,（,（重,组,组）,，,，最,后,后将,重,重组,体,体转,入,入宿,主,主细,胞,胞，,使,使外,源,源基,因,因DNA,在,在宿,主,主细,胞,胞中,，,，随,细,细胞,的,的繁,殖,殖而,增,增殖,（,（cloning,，,，克,隆,隆）,，,，或,最,最后,得,得到,表,表达,，,，最,终,终获,得,得基,因,因表,达,达产,物,物或,改,改变,生,生物,原,原有,的,的遗,传,传性,状,状。,一、DNA,重组,的,的技,术,术路,线,线,二、基因,工,工程,的,的应,用,用与,前,前景,三、DNA体,外,外重,组,组常,用,用的,酶,酶,返回,DNA,重组,的,的,技,技术,路,路线,Foreign DNA to be inserted,Plansmid vector,Joining,Recombinant DNA molecule,Introduction into host cells by transformation of viral infection,Host chromateme,Slection for cells coteining a recombinant DNA molecule,Cloning,+,1、,目,目的,基,基因,的,的制,备,备2、载体的构,建,建3、,目,目的,基,基因,与,与载,体,体的,重,重组4、,重,重组,体,体导入宿主,细,细胞,进,进行,扩,扩增5、克隆,基,基因,的,的鉴,定,定,Ti,质,质粒,结,结构,植物,冠,冠瘿,瘤,瘤,pBR322,质粒,的,的结,构,构,以,噬菌,体,体为,载,载体,进,进行DNA克,隆,隆,DNA,用限,制,制性,内,内切,酶,酶除,去,去中,间,间一,段,段,与外,源,源DNA,连,连接,重组,载,载体,的,的体,外,外包,装,装,带有,外,外源DNA的,噬菌,体,体,太小,不,不能,被,被包,装,装,头部前体,多联体DNA,A,蛋白,COS,COS,COS,成熟的颗粒,在宿主细胞内进行DNA的装配过程,噬菌,体,体感,染,染大,肠,肠杆,菌,菌的,途,途径,DNA重,组,组体,的,的筛,选,选,载体,特,特征,的,的直,接,接筛,选,选,菌落,的,的原,位,位杂,交,交,免疫,学,学方,法,法,pBR322,质粒,结,结构,如果,外,外源DNA插,入,入，,氨,氨卞,青,青霉,素,素抗,性,性基,因,因失,活,活,如果,外,外源DNA插,入,入，,四,四环,素,素抗,性,性基,因,因失,活,活,原位,杂,杂交,法,法筛,选,选DNA,重,重组,体,体图,解,解,复印,至,至硝,酸,酸纤,维,维素,膜,膜上,用NaOH菌,体,体裂,解,解DNA,变,变性,杂交,放射,自,自显,影,影,32,P-cDNA,与放,射,射性cDNA,杂,杂交,的,的菌,落,落的,斑,斑点,细菌,菌,菌落,单链DNA结,合,合到,膜,膜上,Southern,印迹,法,法,DNA分,子,子,限制,片,片段,限制,性,性酶,切,切割,琼脂,糖,糖电,泳,泳,转移,至,至硝,酸,酸纤,维,维素,膜,膜上,与放,射,射性,标,标记DNA探,针,针杂,交,交,放射,自,自显,影,影,带有DNA片,段,段的,凝,凝胶,凝胶,滤膜,用缓,冲,冲液,转,转移DNA,吸附,有,有DNA,片,片段,的,的膜,Southern,和,和Western,印迹,法,法,DNAfrangment,Electrophoresis,TransferofDNAbyblotting,32,P-labledDNAprobe,Autoradiography,Agarrosegel,Autoradiogram,Nitrocellulosesheet,Autoradiogram,Polymersheet,SDS-Polyacrylamidegel,Transferprotein,Addradiolabledspesficantibody,Washtoremoveunboudantibody,Proteinbanddetected byspecific antibody,Autoradiography,DNA重,组,组技术的,应,应用,(1),开,开辟生物,学,学研究的,新,新纪元,反向生物,学,学（invesebiology,）,）的诞生,（2）促,进,进生物技,术,术产业的,兴,兴起,基因药物,基因诊,断,断和治疗,转基因动,植,植物,胰岛素原,的,的人工合,成,成,胰脏,(A)n,胰岛素原mRNA,cDNA,重组质粒,转化细菌,mRNA,反转录酶,胰岛素原,基,基因,与质粒连,接,接,感染E.coli,胰岛素原,Ti,质粒为载,体,体的植物,基,基因工程,I,二,二元载体,系,系统,II,共整合载,体,体,IIIT-DNA,的转移与,整,整合,Ti,辅助质粒,Ti,辅助DNA给体质,粒,粒,Ti,辅助DNA给体质,粒,粒,pBR型,质,质粒（,给体质粒,）,）,宿主特异,性,性,外源基因,宿主特异,性,性,整合,带有外源,基,基因的Ti,质粒,植物DNA,Ti,质粒转移,并,并插入植,物,物DNA,第二节,蛋,蛋,白,白质工程,简,简介,蛋白质技术和核,酸,酸技术的,相,相互增强,在广泛利,用,用自然界,存,存在的各,种,种蛋白质,的,的过程中,发,发现。这,些,些蛋白质,只,只是适应,生,生物自身,的,的需要，,而,而对于它,们,们的产业,化,化开发往,往,往并不合,意,意，需要,加,加以改造,。,。1983年美国,基,基因公司,的,的Ulmer首先,提,提出蛋白,质,质工程这,个,个名词，,它,它是指按,照,照特定的,需,需要，对,蛋,蛋白质进,行,行分子设,计,计和改造,的,的工程。,自,自此之后,，,，蛋白质,工,工程迅速,发,发展，生,物,物工程的,重,重要组成,部,部分。,蛋白质工,程,程首先是,以,以蛋白质,的,的结构为,基,基础，通,过,过蛋白质,一,一级结构,、,、晶体结,构,构和溶液,构,构象的研,究,究，积累,成,成千上万,蛋,蛋白质一,级,级结构和,高,高级结构,的,的数据资,料,料,，然后按,照,照蛋白质,形,形成的规,律,律，经周,密,密的分子,设,设计，改,造,造蛋白质,或,或构建新,的,的蛋白质,。,。,研究得多,，,，取得成,果,果最显著,的,的是生物,技,技术药（,激,激素、细,胞,胞因子、,酶,酶、酶的,激,激活剂、,受,受体和配,体,体、细胞,毒,毒素和杀,菌,菌肽以及,抗,抗体等）,和,和工业用,酶,酶的蛋白质工,程,程。,生物酶工,程,程示意图,酶的蛋白,质,质结构功,能,能,新酶分子,蓝,蓝图,选择性修,饰,饰方案,突变酶,新酶,克隆酶,产品,效用,发展,酶基因,遗传设计,遗传修饰,DNA,重组技术,DNA,重组技术,蛋白质技,术,术和核酸,技,技术的相,互,互增强,插入表达,载,载体,转化寄主,细,细胞,推导出AA顺序,制备合成,肽,肽,制备对所,编,编码蛋白,专,专一的抗,体,体,基因或cDNA,蛋白质,蛋白质,测定出AA顺序,合成cDNA探针,制备专一,的,的抗体,沉淀核糖,体,体分离mRNA,用Southern印迹法,筛,筛选DNA文库,基因或cDNA,第三节,核,核酸研,究,究技术简,介,介,一、DNA序,列,列测定,二、基因文库,与,与cDNA文库,三、聚合酶链,式,式反应（,polymerase chainreaction,PCR）,DNA测,序,序的基本,战,战略,设法产生,带,带标记的,不,不同长度,的,的成套DNA片段,，,，各带有,标,标记的片,段,段起点相,同,同、终点,不,不同，使,待,待测的DNA链中,的,的相应每,个,个核苷酸,处,处都有断,裂,裂或终止,。,。通过PAGE电,泳,泳，能够,将,将相差一,个,个核苷酸,的,的DNA,片,片段分开,，,，放射自,显,显影后，,根,根据长短,排,排列，根,据,据特定末,端,端碱基的DNA片,段,段就可读,出,出待测DNA的碱,基,基序列。,酶法化学法测序技术,进,进展,酶法序列,分,分析的原,理,理,酶反应,电泳方向,模板,CCGGTAGCAACT,3,5,GG,5,3,引物,dATPdCTPdGTPdTTP,+,ddATP,dATPdCTPdGTPdTTP,+,ddTTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+,ddGTP,dATPdCTPdGTPdTTP,+,ddCTP,GGCCA,GGCCATCGTTGA,GGC,GGCC,GGCCATC,GGCCATCGTTG,GGCCATCG,GGCCAT,GGCCATCGT,GGCCATCGTT,ACGT,AGTTGCTACC,3,5,TCAACGATGG,5,3,读出模板互补序列,读出模板序列,GGCCATCGTTGA,GGCCATCGT,GGCCATCGTTG,GGCCATCGTT,GGCCATCG,GGCCATC,GGCCA,GGCCAT,GGCC,GGC,DNA,的,的Sanger测序,法,法(,酶,酶法),读出模板互补序列,dNTP,凝胶电泳,较大片段,较小片段,ddGTP,ddATP,ddCTP,ddTTP,反应混,合,合物,Klenow,酶,未知序,列,列的单,链,链DNA,读出待测序列,CTGACTTCGACAAAGAA,5,3,放射性标记的引物,TGTT,A C T G,ddG,ddG,ddG,ddG,GACTGAAGCTGTT,3,5,CTGACTTCGACAA,5,3,DNA,的,的测序,仪,仪示意,图,图,computeranalysis,凝胶中DNA,移,移动方,向,向,样品槽,激光器,输入光,学,学系统,成象透,镜,镜,聚焦透,镜,镜,高灵敏,度,度相机,旋光镜/棱镜,组,组件,DNA,的,的化学,测,测序示,意,意图,反应试,剂,剂,G反应,：,：硫酸,二,二甲酯,G+A,反,反应：,甲,甲酸,T+C,反,反应：,肼,肼,C反应,：,：NaCl+,肼,肼,测序技,术,术进展,同位素,标,标记到,荧,荧光标,记,记,平,板,板电泳,到,到毛细,管,管电泳,多色荧,光,光标记,毛细管,电,电泳,单色荧,光,光标记,平板电,泳,泳,同位素,标,标记,平板电,泳,泳,A,C,G,T,A,C,G,T,测序图,谱,谱,TATTGCAT TGTCTGCATTGTCT,引物标,记,记法测,序,序(DyePrimer),一个样,本,本，4,个,个反应,。,。4个,反,反应中,引,引物序,列,列相同,，,，但分,别,别标记,有,有不同,颜,颜色的,荧,荧光。,+,AmpliTaq FS enzyme,dCTP,dATP,dGTP,dTTP,dd,A,TP(terminator),+,AmpliTaq FS enzyme,dCTP,dATP,dGTP,dTTP,dd,C,TP,+,AmpliTaq FS enzyme,dCTP,dATP,dGTP,dTTP,dd,G,TP,+,AmpliTaq FS enzyme,dCTP,dATP,dGTP,dTTP,dd,T,TP,反应结,束,束后，,将,将4管,反,反应液,混,混合，,经,经乙醇,沉,沉淀后,上,上样,终止法,测,测序(DyeTerminator