实验五ELISA和补体结合

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验五 1.酶联免疫吸附试验（ELISA)2.补体结合反应,1.酶联免疫吸附试验（ELISA),免疫标记技术,定义：,将抗原,-,抗体反应与标记技术相结合，用,放射性同位素、酶或荧光素,标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。,分类：,放射免疫测定法：,131,I,，,32,P,免疫荧光技术：,FITC(,异硫氰酸荧光素,),，,PE(,藻红蛋白,),免疫酶测定法：,HRP,，,AP,Isotype of antibody:,Immunize Rabbit,Mouse IgG1,Rabbit anti-mouse IgG1,Secondary Ab,免疫酶测定法,(,E,nzyme,I,mmuno,A,ssay,EIA),用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。,辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP),特点：,高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性,高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测,定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值,分类：,酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体,酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。,酶联免疫吸附试验,(,E,nzyme-,L,inked,I,mmuno,S,orbent,A,ssay,ELISA),用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。,1.定义,2.分类,间接法（,Indirect ELISA,）：,将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗,检测液相中未知抗体,双抗体夹心法（,Sandwich ELISA),：,将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗,检测液相中的可溶性抗原,竞争法（,Competitive ELISA),：,将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体,检测液相中的可溶性抗原或抗体,酶联免疫吸附试验,(,E,nzyme-,L,inked,I,mmuno,S,orbent,A,ssay,ELISA),3.原理,（以间接性ELISA为例）,：,显色,实验内容：,间接法测定溶血素 定性检测,实验材料,脱纤维绵羊红细胞,抗原,兔抗绵羊红细胞抗体（溶血素）,待测兔血清,HRP,标记羊抗兔,IgG,二抗,包被缓冲液：,0.05M pH9.6,碳酸盐缓冲液,洗涤液：含,0.05%,Tween,20,的,0.01M pH7.4 PBS,底物缓冲液：,pH5.0,磷酸盐柠檬酸缓冲液,底物溶液：,OPD 10mg,，底物缓冲液,25ml,，,30%H,2,O,2,40L,酶标板，酶标仪,实验方法,1.抗原的处理：,脱纤维绵羊血,加3mL N.S，混匀,2000rpm，5min,加3mL N.S，混匀,2000rpm，5min,取2mL压积红细胞,加入2mL蒸馏水，震荡破碎红细胞,用包被缓冲液稀释成1：400备用,2.包被抗原：,取酶标板，加入100L/孔的抗原稀释液,4，湿盒内，18h,取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,3.加待测血清,标记各孔，加入相应液体100L/孔,1,2,3,4,阴性,空白,阳性,待测,4.加二抗：,37，湿盒内，30min,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,各孔加入酶标二抗100L/孔,37，湿盒内，30min,5.显色：,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,加入底物溶液100L/孔,避光显色，10min,6.观察结果,实验方法,预期结果,阳性：显色为黄色,阴性：无色,1 2 3 4,阴性,阴性,阳性,阳性,注意事项,洗涤彻底，避免交叉污染。,按顺序加样，孔底无气泡。,包被和温育在湿盒内进行。,2.补体结合反应,（Complement fixation Test,CFT）,概念：,补体结合反应：,是指在,补体,的参与下，以绵羊红细胞（SRBC）和溶血素（抗SRBC的抗体）作为,指示系统,的,抗原抗体反应,。,补反中包括,两个系统,五种成分：,待检系统：已知,Ag,或,Ab,、待检,Ab,或,Ag,及仅供一组,Ag-,Ab,系统反应的定量补体。,指示系统：绵羊红细胞和溶血素。,原理：,待测系统,抗原+未知血清,1,2,补体,1,2,Step 1,抗原抗体复合物的形成,Step 2,补体的结合和耗竭,指示系统,SRBC+抗SRBC抗体,Step 3,SRBC的裂解,1,2,1：No Ab；,2：Ab,Ag,待测血清,Ab,阳性,No Ab,阴性,Ag,Ag,Ag,抗原：伤寒菌裂解产物,待测血清：,56,，,30min,补体：豚鼠血清,2%,绵羊红细胞,溶血素,材料：,方法：,1,2,3,4,5,试验管,血清,对照管,抗原,对照管,补体,对照管,SRBC,对照管,待测血清,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.4mL,0.8mL,抗原,补体,N.S,摇匀，37，水浴15min,溶血素,SRBC,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,0.2mL,摇匀，37，水浴15min,（1份/2人）,预期结果：,1管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。,溶血,不溶血,2.,试验管,血清对照管,抗原对照管,补体对照管,SRBC对照管,？,溶血,溶血,溶血,不溶血,绵羊红细胞用前应轻晃混匀，不可剧烈震荡。,各种试剂的吸管不可混用。,注意事项：,