小鼠胚胎操作分析课件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,无忧,PPT,整理发布,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,小鼠胚胎操作,苏铁,小鼠发育须知的数据,实验室用的一些欧洲家养小鼠的一些重要的统计数据,妊娠时间,1920d,断奶时间,3,周,性成熟时间,约,6,周,大约的体重,出生时：,1g,断奶时：,812g,成熟时：,3040g,（雄性雌性）,实验室的寿命,1.52.5,年,平均的窝仔数,约,68,每个繁殖雌鼠所产的窝仔数,48,第一章 小鼠发育概要,1,-,细胞合子,桑葚胚,416,细胞,2,-,细胞胚胎,桑葚胚,胚泡,01dpc,1dpc,2dpc,3dpc,4dpc,4.5dpc,5dpc,6dpc,孵化胚胎，无透明带,前原条期,植入胚胎,原始外胚层中形成前羊膜腔,形成形态明显的胚胎轴,晚原条期,早,-,中原条期,1,7,体节,8,12,体节，胚胎旋转,21,29,体节,13,20,体节,30,34,体节；后肢芽在第,2328,体节段出现,7dpc,7.5dpc,9.5dpc,8.5dpc,8dpc,10dpc,9dpc,6.5dpc,9,10mm,，毛基,12,14mm,11,12mm,14,17mm,35,39,体节，尾基,6,7mm,，前肢板,40,44,体节,7,9mm,，后肢板,11.5dpc,11.0dpc,12dpc,13dpc,16dpc,15dpc,14dpc,10.5dpc,17,20mm,2327mm,19,.522.5mm,18dpc,19dpc,17dpc,第一节 生殖细胞系的起源,PGC,起源于临近前原条期胚胎表胚层区域,1,在,7.0dpc,可以在原肠期的后羊膜褶区域检测到,PGC,在，,PGC,到达生殖嵴,13.0dpc,，每个生殖嵴原基中约有,25000,个,PGC,4,2,3,5,进入生殖嵴后，,PGC,继续发育，最终形成精子和卵子,PGC,的大致迁移路径,尿囊基部,后肠上皮,羊膜褶,表胚层,起源,7.0dpc,接下来,8.0dpc,11.0dpc,生殖嵴,睾丸,卵巢,12.5dpc,雄性,雌性,第二节 精子发生,1.,精子发生的特点,(1),精子发生是连续同步和空间有序分化的,(2),精子发生依赖干细胞群体，这种干细胞群体 具有自我更新和产生后代为精子的能力,(3),Y,染色体在精子发生过程中，对性别决定起着 十分重要的作用,2,.,精子发生的过程,第三节 卵子发生,1.,卵子发生的特点,(1),在第一次减数分裂前，卵母细胞会在双线期停滞很长时间,(2),11.5dpc,的卵母细胞中，只有一条染色体是有活性的，但是到了,12.5dpc,，两条都变得活跃,(3),卵母细胞的基因组去甲基化程度高,2.,卵子发生的过程,第四节 排卵,1.,排卵的过程,少数卵泡在,FSH,的刺激下，积累液体，体积膨胀，向卵巢外周移动，为卵母细胞最后的成熟和排放做好准备,卵母细胞在,LH,的刺激下，发生核的成熟，即：细胞核失去核膜，染色体组装在纺锤体中 ，向细胞外周移动，完成第一次减数分裂,.,第一次减数分裂后的阻滞时期，卵母细胞最终从卵泡中排放出来，知道受精以后，才能刺激第二次减数分裂,即将排除的卵子,第五节 受精,1.,精子的获能：精子进入输卵管壶腹部以后，经过一段时间的成熟，获得了受精的能力。精子获能后将穿透卵丘团和透明带，达到卵母细胞表面,2.,顶体反应：顶体是覆盖于精子头部细胞核前方、介于核与质膜间的囊状细胞器。顶体与精子头部质膜融合，释放出各种水解酶，称之为顶体反应,3.,受精：精子头后区与卵母细胞膜的融合促进了一系列反映的级联发生，称之为受精,4.,透明带反映：受精后，卵母细胞表面发生阻止后来精子入卵的变化，这有助于阻止多精受精的发生,第六节 胚胎的早期发育,1.,卵裂：卵子受精后形成受精卵，受精卵发生核膜解 体，染色体重组等变化后，开始发生卵裂。卵裂所产生的细胞称为卵裂球，每个卵裂秋都具有全能性,2.,桑葚胚：,3,次卵裂后的胚胎，各卵裂球相互靠近，形成一个紧密的细胞球，这样的细胞球称为桑葚胚。桑葚胚内部的细胞与外界环境隔开，可以起到稳定细胞球的作用,3.,囊胚的形成：桑葚胚形成后，卵裂球分泌的液体聚集在细胞间隙，最后在胚胎的中央形成一个充满液体的腔，这个腔称为囊胚腔。随着囊胚腔的扩张，细胞的分化逐渐明显：小而分裂活跃的细胞聚集在外周，形成胚胎外层，继而成为滋养层；大而分裂慢的细胞聚集在内侧，称为内细胞团。此时的胚胎称为囊胚,囊胚,桑葚胚,卵裂球,8,细胞期以后,胚胎的早期发育,卵裂开始,16,细胞期以后,滋养外胚层,内细胞团,外侧,内侧,第七节 胚胎植入子宫,1.,在,5.0dpc,时，滋养层细胞合成的蛋白酶消化透明带，使胚泡从透明带中孵化出来，为附植做好准备,2.,在胚胎植入时，子宫壁紧密闭合，使子宫腔密闭，子宫上皮表面也发生变化，使之接受胚泡的附植。胚泡通过胚胎对侧极附着到子宫系膜对侧的子宫壁上。胚泡植入子宫大致的分布受到子宫蠕动的影响,第八节 滋养外胚层及其衍生物,1.,滋养外胚层：胚胎在植入子宫后，滋养外胚层不再维持单层上皮状态，而是在形态学和生长潜能上发生区域性的分化,2.,壁滋养外胚层：起源于围绕胚泡腔的细胞，这些细胞停止分裂，体积变大，形成含有,1000,倍于单倍体,DNA,的多线染色体，他们也被称为初级滋养层巨细胞,3.,极滋养外胚层：胚胎植入子宫后，极滋养外层向着多个方向扩展,首先，一些细胞围绕胚胎迁移，取代初级壁滋养层巨细胞，并且它们也成为多倍体,然后，极滋养外胚层形成一个指状突起，穿入胚泡腔，形成原肠期以前的胚外外胚层，并把,ICM,衍生物推向它的前方，这个突起发育成中心腔并形成上皮。胚外中胚层形成以后，胚外外胚层向胎盘退缩，在那里形成绒毛膜,最后，一些滋养外胚层细胞继续穿入子宫内膜，形成胎盘的主体，一些胎盘细胞和绒毛膜细胞也变为多倍体,极滋养外胚层,原始内胚层,壁滋养外胚层,4.5dpc,时的胚胎,第九节 原始内胚层和外胚层的分化,1.,原始内胚层首先出现在无极性的内细胞团表面，而剩下的内细胞团核心细胞形成原始外胚层细胞,2.,原始内胚层细胞并不形成胚胎的内胚层组织，而是只形成卵黄囊的胚外侧壁内胚层和脏内胚层,3,原始外胚层细胞系形成胚胎的外胚层，中胚层，内胚层组织，生殖细胞以及胚外膜和胚胎的中胚层成分,内细胞团,内胚层,外胚层,脏内胚层,壁内胚层,原始外胚层,原始内胚层,中胚层,卵黄囊胚外侧,胚胎,第十节 表胚层,1.,在胚胎植入时，胚泡由三种组织细胞系组成，即滋养外胚层、原始内胚层和表胚层。表胚层细胞最少，位于极滋养外胚层和原始内胚层之间,2.,胚胎植入后不久，表胚层细胞组织成一单层上皮，围绕着其中心一个小的空腔,前羊膜腔,3.,表胚层是多发育潜能的组织，实验表明，表胚层是未来胎儿组织的唯一来源，包括体细胞组织，也包括生殖细胞系,第十一节原肠作用：中胚层和终末内胚层的形成,1.,原肠作用：指囊胚细胞有规则的移动，使未来的内胚层和中胚层细胞迁入胚胎内部，而未来的外胚层细胞铺展在胚胎的表面，从而形成原肠胚。其结果是产生了三个胚层,外胚层、内胚层、中胚层,的分化，作为进一步分化的基础,2.,原条：从后端缘区向前伸展的条带，是由表胚层细胞向囊胚腔下陷造成的，引导表胚层细胞的迁移，形成中胚层组织和部分内胚层组织。小鼠胚胎中最早能够识别的原始生殖细胞位于原条后端,3.,原条的作用：原肠作用大约在,6.5dpc,开始，此时原条在胚胎与胚外组织交界的表胚层区域形成，原条的位置标志着未来胚胎的后部,4,中胚层的形成：在原条区，表胚层细胞失去上皮的连续性，细胞通过运动或分层移动到表胚层和脏内胚层之间，形成一个新的胚层，即中胚层,5.,终末内胚层的形成：一些细胞也被内卷到脏内胚层外侧，形成最初的一群终末内胚层，也称为肠内胚层,6.,原条的伸展：之后，中胚层细胞和终末内胚层细胞会随着原条细胞的扩展而进行移动，最终导致胚胎前后体轴不均等形态变化,7.,羊膜褶的形成：扩展的中胚层细胞群推动表胚层的近端和外胚层的远端向前羊膜腔的中部移动，这导致形成了一个显著的嵴，被称为羊膜褶,8.,尿囊的形成：随着体腔的形成，一些从原条后部新生的胚外中胚层形成一个特殊的结构,尿囊。尿囊在中胚层中生长，贯穿体腔并与绒毛膜融合。这就形成了尿囊绒毛膜胎盘的主要成分，并在,胎儿和母体之间提供了营养和废物交换的直接途径,第十二节 尾芽,1.,在原肠作用第十天，尾芽取代原条成为新组织的来源,2.,尾芽组织分裂迅速，在胚胎的后部发育形成体节和侧板中胚层、神经管、脊索和原肠内胚层,第十三节 胚胎旋转,在早体节期，小鼠胚胎呈,U,形，相对于羊膜腔而言，各个胚层在胚胎中是倒转的。外胚层位于胚体的内部，而内胚层位于外部和卵黄囊腔中。胚胎旋转有效地逆转了这种位置关系，使胚胎形成包括动物胚胎经典的,C,形结构。它包括胚胎的头、尾部分别向相反的方向旋转，也包括同时发生的胚体逆时针,180,旋转。这些旋转运动同时也代表着胚胎外膜的完全发育,第十四节 体节及其衍生物,1.,体节及其衍生物代表着脊椎动物胚胎最为明显的分节特征,2.,体节起源于中胚层的一条称为前体节中胚层或体节板的结构前体节中胚层及其衍生物被统称为轴旁中胚层,3.,体节的发生起始于,7.75dpc,，并持续到原肠作用的第,14d,，一共有大约,65,对体节出现，它们沿着胚胎前后轴先后形成,4.,大部分的头骨起源于神经嵴，头部轴旁中胚层的主要衍生物是眼睛和腮弓的肌肉组织,5.,身体两侧的前体节中胚层周期性地同时形成一个上皮围绕的球体，从而产生一对新的体节。所以，体节区的伸长是由末端不断添加新的体节而导致的,6,每个体节一旦形成以后即经历大致相同的成熟过程。上皮性结构大约维持,10h,，然后位于腹侧边缘的细胞扩散开来并向脊索移动；这些细胞代表着生骨节，即脊椎骨和肋骨的前体,7.,在背侧，体节的上皮性组织在生皮肌节中得以维持。中间的生肌节成为将来形成背部和脊椎骨周围的肌肉，而侧部的生肌节细胞形成体壁和四肢的的肌肉,8.,生皮节将来形成躯干和尾巴皮肤的真皮部分,第十五节 侧板和间介中胚层以及它们 的衍生物,1.,体节侧面的中胚层被进一步分为间介中胚层和侧中胚层,2.,侧中胚层分裂为两个部分，形成体腔。在背面，胚体壁被外胚层覆盖并与羊膜中胚层相连；在腹面，胚胎壁与内胚层相邻并与卵黄囊中胚层相连,3.,侧中胚层发育成参与内脏和四肢结缔组织发育的间充质细胞、体腔的间皮以及肠系膜,4.,在,9.09.5,的小鼠胚胎中，躯干后部和临近尾巴的间介中胚层分化成原肾管肾原基,5.,紧接着，肾生殖嵴在躯干中部到尾中部区域出现。尿生殖嵴的侧部形成中肾，而中部成分则形成生殖腺,6.,此外，后部的中肾管形成了一个重要的分支,输尿管芽，它是诱导形成后肾所必需的。被诱导形成肾原基的中胚层是躯体后部的间接中胚层,第十六节 四肢发生,1.,组织切除和嫁接等实验确定了肢芽中三个负责建立成体四肢形态特征的重要区域：顶端外胚层嵴、顶端外胚层下的前进区和极化活性区,2.,肢芽是由表面外胚层包绕的侧中胚层向外生长而产生的,3.,前肢芽最早在大约,9.09.5dpc,出现在临近第,712,对体节处,4.,后肢芽在,9.510.0dpc,出现在,2328,对体节处出现,第十七节 神经化：神经系统的发生,1.,脑和脊髓起源于外胚层原条前部增厚的一条细胞，即神经板，它最早在,7.5dpc,的小鼠胚胎中出现，并且伸长分化成为神经外胚层,2.,神经板形成以后，其形态随之发生剧烈的变化，它的两侧边缘逐渐升高，形成神经褶,3.,神经褶的两侧边缘上卷并相互接触，最终融合形成神经管,第十八节 神经嵴,1.,神经嵴是起源于神经管背侧、神经上皮和表皮外胚层连接部的一个临时细胞群体。神经嵴细胞以单细胞形式进行广泛的迁移，从神经管迁移到背部和腹部的很多部位，并同时分化为多种细胞类型,2.,它们的衍生物包括肾上腺髓质细胞、骨和软骨、黑色素细胞、神经胶质细胞和雪旺细胞，以及不同类型的神经元,第十九节 腮弓和咽区的发生,1.,从,8.0dpc,开始，六对咽弓在胚胎咽区以头尾顺序依次发生，它们组成了头颈部的主要构造元件。每一个咽弓都是由外胚层覆盖的间充质条带，它们以弧形围绕着未来的口腔侧面和底面,2.,最前端的以对腮弓最早形成，并且在远端分叉，分别形成上颌骨和下颌骨的原基。上颌骨和下颌骨的原基在,11dpc,分离，分别形成上颌和下颌,3.,第二对腮弓的生长超过第三对和第四对腮弓，是颈部的主要构成成分,第二十节 肠的发育,1.,胚胎的肠来自于表胚层，大多数的表胚层细胞通过原条前部参与形成肠原基,2.,在肠成为一个与其他组织分离的管道以前，终末内胚层的两侧边缘是与腹部的卵黄囊内胚层向连续的，而且脊索插入在肠的顶壁之内,3.,然后，脊索与内胚层分离开来，形成一个独立的器官。在前方，肠管在咽部的盲端与外胚层形成的原始口腔想接触。由外胚层和内胚层共同形成的膜在,9.0dpc,由于细胞死亡和细胞重新组织而破裂，从而使肠管开口于羊膜腔中,4.,随后，在同样的时间后肠发生，并形成泄殖腔膜。泄殖腔膜后来破裂形成肛门开口。,第二十一节 胚外组织,1.,各种胚外组织形成一个统一的生命支持系统，在子宫中维持、营养并保护胚胎,2.,这些胚外组织形成胎盘、壁卵黄囊、脏卵黄囊以及羊膜,3.,胚外组织中合成蛋白质的速率很高，用以执行某些特定功能，包括：胎儿血清蛋白、脏内胚层的载脂蛋白、细胞外基质糖蛋白等,第二十二节 胎盘的结构与功能,1.,滋养层,:,分为海绵状滋养层和合体滋养层。海绵状滋养层中许多细胞是二倍体，而合体滋养层中大多数细胞是多倍体。两层中都具有包含母体血细胞的血窦,2.,中胚层：在尿囊与绒毛膜融合以后，中胚层形成胚胎的血管。毛细血管与滋养层细胞交互盘绕在一起，从母体血窦中获得营养,3.,脏内胚层和壁内胚层：胎盘的裂隙中既有脏内层也有壁内胚层，脏内胚层合成甲胎蛋白，壁内胚层形成基膜,第二章 转基因小鼠和嵌合体小鼠的生产,绪论：要成功和高效的生产基因工程小鼠，就必须能够获得大量的着床前胚胎和大量的假孕受体。此外，还必须确保动物健康和实施合理的育种计划。本章所描述的内容适用于转基因和基因打靶实验的鼠群，要求畜舍具备能够控制通风、湿度、温度、光照的设施，具备能够进行笼具洗刷、饲料储存、充足供水和兽医服务等条件。可根据实验者的实验需要，对我们所叙述的小鼠品系、年龄和数量进行调整。,第一节 实验鼠群的病原控制,1.,实验鼠群一般都应该饲养在无特定病原体（,SPF,）的环境中,2.,越来越多的动物舍被建成,SPF,舍并实行封闭管理。一般在动物舍，所有人员在入舍前都必须先经过淋浴和换上无菌的装备，所有进入的物品都必须经过高压或其他方法灭菌，笔记本和其他个人物品一般不允许带入舍内,3.,所有用于转基因动物的小鼠都要在规定的封闭区内配种，所有实验操作都必须在舍内进行。在检疫后，断奶的幼鼠才能进入封闭区,4.,有三种方法可以解决胚胎在体外操作后又移植到,SPF,培养母体内的实验室和清洁问题,2.,为方便对外面引进，胚胎供体可位于封闭之外，受体在封闭区内配种，收集的胚胎在洗净后进入封闭区内进行操作,3.,实验室位于封闭区之外，操作后的胚胎通过胚胎移植而进入封闭区,1.,把实验室设置在封闭管理的动物舍内，设备、人员等都在经过净化后才能进入封闭区内。胚胎供体和受体都在封闭区内进行配种,5.,关于,SPF,和非,SPF,鼠群应该考虑的重要问题包括一下,5,个方面,1.,饲养管理与存活率：,SPF,的小鼠更健康，存活时间更久,2.,实验结果：特别是关于免疫系统的实验，即使小鼠表面上看是健康的，病毒等感染也会影响实验结果,3.,方便性：在,SPF,鼠群，接触小鼠往往程序繁琐且费时，必须要有周密的安排活动时间表,4.,费用：在封闭的条件下对小鼠要求更精细的管理步骤，因而需要更多的劳动和额外的设备,5.,小鼠品系的运输：从其他研究单位获得的小鼠品系可能携带病原体，因而必须通过胚胎移植或者剖腹产重生，才能进入,SPF,舍,第二节 提供供体和（或）受体小鼠的育种群,1.,为提供供体小鼠和受体小鼠，应准备若干个配种鼠笼，每只笼内放公鼠和母鼠各一只。幼鼠出生后,3,周龄时断奶并把公母分开,2,要想尽可能多地生产小鼠，幼鼠应该在下一窝小鼠出生之前断奶，以防年龄大的践踏年龄小的和不让它们吃奶。一个有,4050,对公母鼠的育种群，依品系不同，每周应该生产,2030,只母鼠,3.,为增加每笼产雌性幼鼠的数量，一个笼内可放置,2,只母鼠，一只公鼠,第三节 自然交配的安排,1.,获得用于显微镜操作或者其他实验的着床前胚胎的方法之一是通过自然交配，即排卵和受精的时间完全由环境条件控制,2.,在恒大的光照,黑暗周期下饲养的磁鼠一般,45d,排卵一次，时间是黑暗开始后,35h,。,3.,小鼠的发情周期分为,4,个阶段,:,发情前期（卵泡发育）、发情期（排卵）、发情后期（黄体形成）、发情间期（下次排卵的卵泡开始发育，清楚上一次的卵泡细胞）,4.,在同样条件下饲养的雄鼠将于黑暗的中点前后与发情,(,排卵,),雌鼠交配。这意味着受精在排卵后,12h,发生,第三章 外科手术方法,绪论：本章所介绍的外科手术方法是进行转基因和生产嵌合体小鼠及其相关的各种试验研究所必需的基本手术方法。,第一节 输精管及卵巢切除术,1.,用切除输精管的雄性小鼠与雌性小鼠交配，可诱导产生用于输卵管或子宫胚胎移植的假孕受体,2.,发情雌鼠与不育雄鼠交配后，尽管其自身产生的卵母细胞已经退化，但其子宫处于胚胎移植的接受状态,3.,新形成的假孕雌鼠在,11d,内不能恢复正常发情周期,4,摘除卵巢会引起胚胎发育停滞，故摘除卵巢后往往需要补充孕酮。摘除卵巢后孕鼠体内的胚胎仍可存活,10d,左右。延迟发育的胚胎可用于,ES,细胞的生产,第二节 胚胎移植,1.,交配后,0.53.5d,形成的单细胞到囊胚阶段的胚胎，可以移植到假孕雌鼠的生殖道内以使其继续发育,2.,这一时期的胚胎可以移植到假孕,0.5d,小鼠的输卵管壶腹部，而,3.5d,的胚胎可以移植到,2.5,或,3.5d,假孕雌鼠的子宫内。,2.5d,比,3.5d,的假孕雌鼠更适合于进行子宫胚胎移植，因为经过体外操作的胚胎有足够的时间与子宫的发育相适应,第三节 剖腹产手术和子鼠寄养,1.,如果移植胚胎后的受体雌鼠或任何其他孕鼠，在其品系特定的预产期内没有产下子鼠，则很有必要实施剖腹产手术。难产尤其会发生在只有,12,个胚胎着床时，由于胎儿长得过大而无法正常分娩的情况下,2.,如果转基因或基因突变的胎儿在分娩时死亡，为了收集到所有的胎儿用于研究，可以在,18.5dpc,实施剖腹产手术,第四节 实验方案,1.,制作不育雄鼠的输精管切除术,2.,诱导胚胎延迟着床的卵巢摘除术,3.,输卵管内胚胎移植,4.,子宫内胚胎移植,5.,剖腹产手术和子鼠寄养,6.,肾囊下组织移植,7.ES,细胞的皮下注射,8.,肝脏的部分切除术,9.,脾切除术,10.,肾切除术,11.,去势术,12.,尾动脉采血,小鼠胚胎操作,苏铁,内容总结,小鼠胚胎操作。苏铁。外胚层位于胚体的内部，而内胚层位于外部和卵黄囊腔中。4.大部分的头骨起源于神经嵴，头部轴旁中胚层的主要衍生物是眼睛和腮弓的肌肉组织。4.在9.09.5的小鼠胚胎中，躯干后部和临近尾巴的间介中胚层分化成原肾管肾原基。5.紧接着，肾生殖嵴在躯干中部到尾中部区域出现。2.肢芽是由表面外胚层包绕的侧中胚层向外生长而产生的。1.神经嵴是起源于神经管背侧、神经上皮和表皮外胚层连接部的一个临时细胞群体。每一个咽弓都是由外胚层覆盖的间充质条带，它们以弧形围绕着未来的口腔侧面和底面。可根据实验者的实验需要，对我们所叙述的小鼠品系、年龄和数量进行调整。2.越来越多的动物舍被建成SPF舍并实行封闭管理。4.费用：在封闭的条件下对小鼠要求更精细的管理步骤，因而需要更多的劳动和额外的设备。1.获得用于显微镜操作或者其他实验的着床前胚胎的方法之一是通过自然交配，即排卵和受精的时间完全由环境条件控制,