动物细胞培养的准备

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章细胞培养的准备工作,玻璃器皿,金属器械,橡胶,塑料制品,玻璃器皿的清洗,浸泡（自来水） 刷洗（洗衣粉） 酸泡（24小时） 自来水冲洗蒸溜水浸泡和冲洗 50烘干,橡胶、塑料制品的清洗,清水清洗浸于自来水过夜用纱布或棉签和50稀洗液刷洗流水冲洗（1520遍） 晾干浸于清洁液15分钟流水冲洗（1520遍） 蒸馏水浸洗三次，三蒸水泡24小时晾干或50烘干备用。,金属器械的清洗,放到含洗涤剂的水中反复刷洗后自来水反复冲洗干净晾干用75酒精擦拭自来水反复冲洗干净最后三蒸水浸洗3次，晾干或50烘干备用。,正压除菌滤器的清洗,含稀洗涤剂的水中，反复刷洗后流水冲洗15min 漓水蒸馏水浸泡24h 三蒸水浸泡24h 晾干或50烘干备用。,塑料器材,常用的塑料器材有多孔培养板（4孔、6孔、12孔、24孔、96孔）、培养皿、培养瓶及吸头。,重复使用的处理步骤：,自来水刷洗,3,HCl,或,2,NaOH,溶液浸泡过夜,自来水充分冲洗 双蒸水冲洗,3,次,紫外线直接照射或辐照灭菌,清洗时应注意： 浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。 冲洗时要流水振荡冲洗，方法是：每瓶灌2/3容积的自来水，振荡后倒掉，重复15-20次。 煮沸前水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂,配制时先在容器中加入蒸馏水，加热溶解重铬酸钾， 再将容器置流动自来水中，待重铬酸钾液冷却后， 缓慢加入浓硫酸，边加边搅拌。,重铬酸钾（克）,浓硫酸（毫升）,蒸馏水（毫升）,弱液,100,100,1000,次强液,120,200,1000,强液,63,1000,200,组成,强度,包装材料：牛皮纸,硫酸纸,铝箔,纱布,金属消毒桶,铝质饭盒,方式：全包装,局部包装,包装时应注意：手指与器材接触面积要小，手指不能触及器材的使用端；封闭器材使用端，标记器材手持端；小包装；玻璃管道口（尖吸管、移液管手持端等）加棉花。,消毒灭菌方法,清除或杀灭物品 上的一切微生物, 以杀灭芽孢为准,物理法1：紫外线消毒,紫外线直接照射消毒是各实验室常用的方法；,主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒。,紫外线消毒时产生臭氧，对身体有害，故紫外线消毒停止后30分钟才可入室工作。,目前有的实验室采用电子灭菌灯代替紫外灯进行空气消毒。,紫外线消毒法是利用紫外线照射，使菌体蛋白发生光解、变性，菌体内的核酸、酶遭到破坏而死亡的一种消毒方法。紫外线的杀菌力与其波长密切相关，,最佳杀菌波长,为,250-270nm,.,光照消毒法,主要利用,紫外线,照射，使菌体蛋白发生光解变性而导致细菌死亡，常用方法有： 日光曝晒消毒法 日光曝晒法用于枕头、床褥、床垫、棉絮等的消毒，一般曝晒,6 h,可达到消毒，曝晒时,2 h,翻面一次 紫外线消毒法 紫外线消毒法用于空气消毒与物品表面的消毒,物理法2：干热消毒,干热,是指相对湿度在20%以下的高热，由空气导热，传热 较慢，干热消毒灭菌常用的方法;,1.焚烧灭菌法;,2.燃烧灭菌法;,3.干烤消毒灭菌法:用于高温下不变质、不损坏、不蒸发的物品，如油剂、粉剂、玻璃器具、金属制品等;,玻璃器皿，160,o,C 90-240mins,4.,微波消毒灭菌法:用于食品及餐具的消毒,医疗药品及耐热非金属材料物品的消毒灭菌,物理法3：滤过消毒,目前细胞培养工作中采用的培养用液，包括人工合成培养液、血清、消化用胰酶等常含有维生素、蛋白、多肽、生长因子等物质，这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能，因而上述液体多采用滤过消毒以除去细菌,。,滤膜使用时应注意：滤膜薄且光滑，容易移动，安装时膜位置一定要放正。过分干燥的滤膜很脆，在高压或高温干燥时易破裂，因此安装前可先用三蒸水润湿滤膜。为保证过滤效果，在使用时，每次垫两张滤膜，上面一张孔径为045微米，下面一张孔径为022微米，或两张均为022微米。使用无齿玻片镊子夹取滤膜，以防止镊齿弄破滤膜。加大压力时用力应均匀，用后打开滤器对光检查滤膜是否移动和有无破裂。,用于滤过除菌的各式滤器,滤过除菌法：培养基、血清、消化酶、抗生素等。,物理法4： 湿热灭菌,湿热由,空气,和,水蒸气,导热，传热快，穿透力强，湿热消毒灭菌常用的方法： 煮沸消毒法 高压蒸汽灭菌法，一般高压蒸汽灭菌的压力为,102. 97-137.30,kPa，温度为,121126,0,C,经,15-30 min,可达到灭菌目的,最常用、最有效的方法；,布、金属、橡胶、玻璃、某些培养液,培养液，橡胶：10磅（115,o,C）20mins；,玻璃、金属： 12磅（121,o,C）30mins；,高压蒸汽灭菌器,化学消毒灭菌法,化学消毒灭菌法,是利用化学药物渗透细菌体内，使菌体蛋白凝固变性，干扰细菌酶的活性，抑制细菌代谢和生长或损害细菌膜的结构，改变其渗透性，破坏其生理机能等，从而达到消毒灭菌目的,化学消毒剂的使用原则,(1)根据物品的性能及微生物的特性，,选择合适的消毒剂。,(2)严格掌握消毒剂的,有效浓度、消毒时间及使用方法。,(3)消毒剂应,定期更换,，易挥发的消毒剂要加盖，并定期检测，调整其浓度。,(4),浸泡前将物品洗净擦干,，浸没在消毒液内的物品应注意打开轴节或套盖，管腔内应注满消毒液。,(5),在使用前用无菌生理盐水冲净消毒后的物品,，避免消毒剂刺激人体组织,化学消毒剂的分类,l、,高效消毒剂,高效消毒剂可杀灭一切微生物，包括芽孢 (碘酊、福尔马林等),2、,中效消毒剂,中效消毒剂可杀灭细菌繁殖体，不能杀灭芽孢(乙醇、碘伏等),3、,低效消毒剂,低效消毒剂可杀灭细菌繁殖体，不能杀灭结核杆菌、亲水性病毒或芽孢(苯扎溴铵、氯己定等),化学消毒剂的使用方法,浸泡法,侵泡法是将物品洗净、擦干后，浸没在消毒液中进行消毒灭菌的方法。,擦拭法,擦拭法是用消毒剂直接擦拭人体或物品表面，如皮肤、桌椅等，达到消毒灭菌的方法。,喷雾法,喷雾法是利用喷雾器将消毒剂变成微粒气雾弥散在空气中对空气和物品表面进行消毒灭菌的方法。,熏蒸法,熏蒸法是将消毒剂加热或加人氧化剂，使其产生气体来进行消毒灭菌的方法。,常用消毒剂,过氧乙酸,peracetic acid,福尔马林,formalin （37 -40%的甲醛溶液),戊二醛,glutaraldehyde,环氧乙烷,ethylene oxide,含氯消毒剂,乙醇,alcohol,苯扎漠铵(新洁尔灭),过氧乙酸,消毒效力：高效,0.2,用于手消毒，浸泡1- 2min,0.5,用于用具消毒，浸泡30 - 60 min,0.2 -0.5,用于物体表面消毒，或浸泡10 min,1 -2,用于空气消毒，8 mL/m,3,，加热熏蒸，密闭门窗30-120 min,注意事项：,对金属有腐蚀性，不可用于金属器械的消毒；,易氧化分解而降低杀菌力，需现配现用；,浓溶液有腐蚀性，配制时要戴口罩和橡胶手套；,存放于阴凉避光处，防高温引起爆炸；,福尔马林(37 -40%的甲醛溶液),消毒效力：高效,40甲醛210 mLm,3,加水420 mL加热，作室内物品及空气消毒；,40甲醛4060 mLm,3,加高锰酸钾2040 g，柜内熏蒸，密闭612 h；,10甲醛可作浸泡器械消毒,注意事项：,蒸汽穿透力弱，因此衣服应挂起消毒；,消毒效果易受温度、湿度影响，要求室温在,18,以上，相对湿度在,70,以上；,对人体有一定毒性和刺激性，使用时注意防护；,戊二醛,消毒效力：高效,浓度和用法：,2,戊二醛溶液加入0.3碳酸氢钠，成为2碱性戊二醛，用于浸泡不耐高温的金属器械、医学仪器、内镜等，,消毒需10-30 min，灭菌需7-10 h.,注意事项：,每周过滤1次，每2周应更换消毒液1次；,浸泡金属类物品时，加入,0.5亚硝酸钠作为防锈剂 ；,消毒灭菌后的物品，使用前用无菌蒸馏水冲净,含氯消毒剂,含氯消毒剂：,常用的有漂白粉,消毒效力：中、高效,浓度和用法： 0.5漂白粉溶液、0.51氯胺溶液用于浸泡餐具、便器等，浸泡30 min ；,13漂白粉溶液、0.53氯胺溶液喷洒或擦拭地面、墙壁及物品表面；,排泄物消毒：干粪5份加漂白粉1份搅拌，放置2 h，尿液100 mL加漂白粉1 g，放置1 h,注意事项：,消毒剂保存在密闭容器内， 置于阴凉、干燥、通风处，减少有效氯的丧失；,配制的溶液性质不稳定，应现配现用；,有腐蚀及漂白作用，不宜用于金属制品、有色衣服及油漆家具的消毒；,3 d更换一次消毒液,乙醇,消毒效力,：中效,浓度和用法,：,70-75用于皮肤消毒,95用于燃烧灭菌,注意事项,： 易挥发，需加盖保存，定期测定，保持有效浓度 有刺激性，不宜用于黏膜及创面消毒 易燃，故应置于避火处,苯扎漠铵(新洁尔灭),消毒效力：低效,0.1-0.2用于皮肤消毒,0.1%-0.2用于金属器械消毒，浸泡15-30 min (加入0.5亚硝酸钠以防锈),注意事项： 对肥皂、碘、高锰酸钾等阴离子表面活性剂有拮抗作用,有吸附作用，会降低药效，所以溶液内不可投人纱布、棉花等,对铝制品有破坏作用，故不可用铝制品盛装,75酒精、新洁尔灭、过氧乙酸、乳酸和洗必泰等都是常用的有效消毒剂。,0.5的过氧乙酸在10分钟内可将芽孢菌和各种病毒杀死；,乳酸蒸汽常用做无菌室内或周围环境的定期消毒；,75酒精常用于超净台的台面、器械、实验操作者的皮肤等的消毒;,0.1新洁尔灭用于对桌、椅、地面、皮肤、操作台面进行擦拭或浸泡消毒；,0.1洗必泰水溶液用于皮肤浸泡消毒,。,总结：物理消毒,（1）射线消毒：,60Co、X射线，用于血清和塑料制品灭菌。,（2）紫外线：,器皿需结合75酒精浸泡，照射30min。,（3）干热灭菌：,160C，90120 min。主要用于玻璃、金属器皿。,（4）湿热灭菌：,121C，30 min；适用布、橡胶、某些塑料、金属、玻璃等。,（5）过滤除菌：,用孔径小于0.22,m的滤膜过滤，适用于培养用液和其他不能高压灭菌的溶液。,总结：化学消毒,（1）70（75）酒精：,用于手、器械、工作台面。,（2）0.1新洁尔灭：,主要用于手的清洗和工作台面的清洗,。,（3）来苏水：,主要用于桌椅、墙壁、地面的消毒，也可用于空气消毒,。,（4）0.5%过氧乙酸：,10min可将芽孢菌杀死，用于表面消毒。,（5）其他：,乳酸、甲醛、高锰酸钾、氯等,。,无菌室的灭菌,：,1.定期打扫,无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3来苏尔或者新洁尔 灭或者0.5过氧乙酸擦拭。,2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3新洁尔灭擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5过氧乙酸，再用紫外灯照射,3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟,4.实验后灭菌：用75酒精（3新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。,实验人员的无菌准备,：,1.肥皂洗手。2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75酒精棉球擦净双手。,无菌操作的注意事项,：,1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。,培养前准备,器材,物品,放到操作场所（培养室、超净台）内消毒。,操作间消毒,每天0.2% 新洁尔灭拖地；,每天紫外线照射分钟,超净台在,每次试验前,用酒精擦拭，然后紫外线消毒分钟,洗手和着装,火焰消毒,操作：,动作准确敏捷,避免手碰到器皿,布局合理,瓶口顺风,不同移液管取液,不能讲话、咳嗽,专门人配液，灭菌，标签,一切用品固定存放；,“,避免污染,”,第二节、细胞培养用液,水：,平衡盐溶液（BBS） ：,消化液：,培养基,抗生素液：,染色液：,（一）水,（二）平衡盐溶液,维持渗透压、调节,PH,值,细胞生存能量、无机离子,成分,：无机盐葡萄糖,用途,：洗涤,配制其他溶液的基础溶液,可加指示剂,BBS 作用,：,提供细胞生长的基本元素；,维持渗透压、缓冲和调节酸碱度；,平衡盐溶液：无Ca,2+,、Mg,2+,的缓冲液,PBS： NaCl 8.0 g,KCl 0.2 g,Na,2,HPO,4,.H,2,O 1.56 g,KH,2,PO,4,0.20g,加水至1000 ml,（三）消化液,作用,：贴附型细胞原代培养和传代培养过程中细胞和组织的分散；,胰蛋白酶液：使细胞间蛋白质水解， 细胞分散,EDTA（二乙烯四乙酸二钠）：,吸取Ca,2,，Mg,2,，使细胞分离,胶原酶 原代培养分散组织细胞,联用,胰蛋白酶消化液,来源：猪或者牛的胰脏，白色粉末,作用：水解细胞之间的蛋白质,浓度：0.25% 0.125%,特点：不同细胞的要求不同,终止：血清可以中止胰蛋白酶的继续作用,EDTANa,又称Versen溶液,化学鳌合剂,对细胞具有一定的解离作用,毒性小，价格低,0.02%,胶原酶溶液,来源：细菌,作用：对胶原组织和细胞间质有较强的消化作用。,细胞培养用容器及培养基,Culture vessels and medium,for animal cell culture,二、培养基（液）,培养基（液）是维持体外细胞生存和生长的溶液,天然培养基：,合成培养基：,氨基酸、维生素、糖类,无机离子、其它成分,完全培养基：,合成培养基+血清,无血清培养基：,（一）天然培养基,天然培养基有生物性液体（血清）， 组织浸液（胚胎浸液），凝固剂（血浆）,优点：营养成分丰富，培养效果好,缺点：,来源受限。,成分复杂，,影响对某些实验产物的提取 和实验结果的分析,。,易发生支原体污染,血清(serum)：,一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它动物血清。,灭活：56度，30min消除补体活性。,球蛋白不高于2g/100ml,外观：透明淡黄色，无溶血，无沉淀。,1、血清,常用血清有胎牛血洁,新生牛血清,小牛血清,兔血清,马血清等,其中以胎牛血清质量最好.,优质血清的标准:透明,淡黄色,无沉淀物,无细菌,支原体,病毒污染.,多种,PR,（,白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）,多种金属离子,激素；,促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。,各种生长因子,转移蛋白,不明成分,血清的使用与储存,使用前的处理,56灭活30min,去除补体成分,储存条件,灭活后分装成小包装（10mL、20mL、50mL），20 储存；使用前4 融化，可用1个月。,使用浓度,一般为520，最常用的是10。,影响血清的各种因素,年龄：,较老动物的血清对细胞生长有抑制作用,血型：,AB,型血清比,A,型和,O,型血清对细胞生长有利,血色素,胆红质,脂肪酸,血清在培养液中的浓度并非越高越好,细胞培养中使用血清的缺点,使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态。,如：血清可以促进成纤维细胞的生长，同时会抑制表皮角质细胞的生长。,血清中含有一些物质对细胞会产生毒性作用。,如：多胺氧化酶,每批血清之间都有差别,，其成分不能保持一致。,取材过程中有可能带入,支原体、病毒,，对培养细胞产生影响。,关于血清的几个问题,血清必须贮存于20 -70，若存放于4，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将4045 ml分装于无菌50ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。,一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。,瓶装,(500ml),血清解冻步骤,(,逐步解冻法,): -20,或,70,至,4,冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以,50 ml,无菌离心管可分装,40,45 ml,。,在溶解过程中须规则摇晃均匀,(,小心勿造成气泡,),，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由,20,直接至,37,解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。,血浆：1907年Harrison首次使用,优点：支持培养组织块，供给细胞生长物质。,缺点：易于液化。,2、血浆,阅读：P484、水解乳蛋白5、胶原,回答：胶原在细胞培养中的用途？,胶原的制备方法？,胶原的使用方法？,（二）合成培养基,合成培养基：根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。,主要成分,：氨基酸、维生素、碳水化合物、无 机盐和其它一些辅助物质。,优点：,标准化生产，组分和含量相对固定。,成本低,缺点：,缺少某些成分，不能完全满足体外细 胞生长需要。,常用合成培养基,MEM: 12种氨基酸,+谷氨酰胺,+ 8种维生素,广泛适用已建成细胞系的培养,minimum essential medium,DMEM:,MEM改良,成份加倍,葡萄糖(高糖1000mg/L或者低糖400mg/L),低糖: 生长速度快,附着性稍差的肿瘤细胞 ;,高糖: 附着性差的细胞,RPMI-1640:,成份简单, 正常细胞和肿瘤细胞,广泛适用,干粉培养基,商品培养液,完全培养基,也叫血清培养基;,分成细胞生长和细胞维持培养基,细胞生长培养基:,血清含量高, 10-20%,维持培养基:,血清含量低, 2-5%,完全培养基配制举例:,基础培养基,80,一,95,血清,5,一,20,碳酸氢钠,2.0 g/L,青霉素,50100IU/ml,培养液,链霉素,50100ug/ml,培养液,配制:,RPMI-1640,培养粉,1,袋,碳酸氢钠,2.0 g,青、链霉素 各,100IU/ml,加三蒸水至,1000ml,过滤除菌,调节,pH,值至,7.2 ,加血清（终浓度,10,）,.,（三）无血清培养基,血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，故在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。,在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞,1975,年，,Sato,首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近,20,多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。,无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。,向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使,同源组织的不同细胞株，所需,补加物,也不同。,商品化的无血清培养液供应。如：,Sigma,公司的,MCDB131,可用于培养内皮细胞,Biofluids,公司的,LHC-9,用于气管上皮细胞,提高制品安全性和,/,或产量,.,无血清培养基,替代血清的补充成分,优点,：增加确定性；,性能更一致；,容易进行纯化和下游加工；,缺点,：无血清培养基尚处于研究阶段难以推广。,基础培养基,无血清培养基加入添加剂,生长因子和激素,结合蛋白,贴附因子和伸展因子,有利细胞生长的因子和元素,提高重复性,减少微生物污染,供应充足稳定,产品易纯化,避免血清因素对细胞的毒性,减少血清中蛋白对生物测定的干扰,抗生素:,在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。,青霉素（50100IU/ml培养液）,链霉素（50100,ug,/ml培养液）,抗菌素的使用:,在培养液配制后,培养液内常加适量抗菌素,以抑制可能存在的细菌的生长.,通常是青霉素和链霉素联合使用.,培养基内青霉素,链霉素最终使用浓度为每毫升100单位.,培养基的组成,基础培养基 80%一95%血清 5%一20%碳酸氢钠 2.0 g/L青,链霉素,各,100卑位/毫升,物理性质,1、pH值：,正常成纤维细胞：pH7.47.7；转化细胞：pH7.07.4。,酚红的呈色：,2、缓冲盐：碳酸氢钠 3、渗透压 4、粘度,紫色,红带蓝,红色,橙色,黄色,呈色,7.8,7.6,7.4,7.0,6.5,pH,其它常用液,P50,