高中生物选修专题一基因工程

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程专题复习,近五年，基因工程只要考点：,1、基因工程的工具；限制酶，DNA连接酶，运载体单独考察比较少。,2、基因工程的操作步骤中，目的基因的获取年年考。重点考察“从基因文库与CDNA文库的构建过程及区别”另外，“基因表达载体的构建”也是考察的重点。经常与限制酶、DNA连接酶一起考察，涉及启动子、终止子、标记基因等。,3、导入受体细胞的考察较简单，2010与2013年主要集中在导入动物和植物细 胞中。,4、目的基因的检测与鉴定是重点考察内容，每年都有涉及，分子水平和个体水平都考察，重点理解分子杂交；蛋白质工程考察较少。,什么叫基因工程？,基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。,（一）基因工程的概念,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,（二）DNA重组技术的基本工具,分子手术刀限制性内切酶,分子缝合针DNA连接酶,分子运输车运载体,识别双链DNA 分子的某种,特定的核苷酸序列,，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的,磷酸二酯键,断开。,主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。,4000种。,1、来源：,2、种类：,3、作用：,4、结果：,形成两种末端,一、“分子手术刀”限制性核酸内切酶,粘性末端,平末端,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,什么叫平末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,限制性内切酶,特点：,特异性，即识别特定核苷酸序列，在特定的切点切割。,举例：大肠杆菌的一种限制酶（,EcoR),能识别,GAATTC,序列，并在,G,和,A,之间切开形成黏性末端，,Sma,能识别,CCCGGG,序列，并在,C,和,G,之间切割形成平末端。,拓展,（EcoR)能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端，,在切开后的序列正着读和反着读碱基序列都一样称之为,回文序列,回文对：,乾 隆,客上天然居，居然天上客；,纪晓岚,人过大佛寺，寺佛大过人。,二、,“分子缝合针”DNA连接酶,1、,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，是把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子才能形成。,DNA,连接酶,分子缝合针：,E.coli,DNA,连接酶：只能连黏性末端。,T,4,DNA,连接酶：还能连平末端，但效率较低。,来源：前者源于大肠杆菌；后者源于,T,4,噬菌体。,大肠杆菌,T,4,噬菌体,不同来源,DNA,片断结合,双链断开,Eco,RI,切割,1.,作用：,要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是,运载体,。,将外源基因送入受体细胞。,3、,分子运输车运载体,2、载体的种类,1、,质粒：是一种裸露、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，具有自我复制能力的双链环状DNA分子；,2、,噬菌体的衍生物；,3、动植物病毒等。,作为运载体必须具备,的,条件,1.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。,2.具,有一个或,多个限制酶,切割,点，便,于供,外源,DNA片段插入,。,3.具有,特殊的,标记基因，,供重组DNA的鉴定和选择,。,3,.,质粒,特点,：,三、,基因工程的基本操作程序,二,、,基因表达载体的构建,三、将目的基因导入受体细胞,四、目的基因的检测与鉴定,一,、,目的基因的获取,一,、,目的基因的获取,1.基因的结构,2.目的基因的概念,3.,目的基因的获取的方法,1.基因的结构,（1）,原核生物基因结构,编码区,非编码区,非编码区,编码区上游,编码区下游,编码蛋白质,调控遗传信息的表达,（调控程序）,A,ATGTGCACGTAGTTA,G,T,TACACGTGCATCAAT,C,启动子,终止子,编码区,非编码区,非编码区,（能编码蛋白质）,启动子,终止子,真核与,原核生物基因结构的比较,外显子,内含子,编码蛋白质,（不能编码蛋白质）,相同点：,都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区。,不同点：,原核细胞基因的编码区是连续的；真核细胞的编码区是间隔的，不连续的。,（2）,真核生物基因结构,2.目的基因的概念,主要是指编码,蛋白质,基因，也可以是一些具有调控作用的因子。,目前被广泛提取使用的目的基因有：,苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因,（抗病毒、抗细菌)、,人胰岛素基,因等。,3.,目的基因的获取的方法,（3）用化学方法直接,人工合成目的基因,（1）,从基因库中获取目的基因,（2）,应用,PCR技术扩增目的基因,（1）从基因库中获取目的基因,基因文库和部分基因文库的慨念,基因组文库和,cDNA,文库的主要区别,怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因,基因文库和部分基因文库的慨念,：,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为,基因文库,。,基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做,基因组文库,。,基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做,部分基因文库,。如：,cDNA,文库,。,基因组文库的建立方法,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与运载体连接,导入受体菌中储存（,基因组文库）,目的基因,分离,部分基因文库的建立方法,mRNA,反转录酶,单链DNA,合成,双链DNA（cDNA）,载体,插入,导入,受体菌群（cDNA文库）,分离,目的基因,cDNA合成过程,第一步：反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的,DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。,第二步：核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降,解，使之变成单链的DNA。,第三步：以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合,成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,26,基因组文库和,cDNA,文库的主要区别,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因,根据目的基因的有关信息,例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物,mRNA,，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。,（2）,应用,PCR技术扩增目的基因,定义：,原理：,DNA,复制,PCR是多聚酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，在短时间内大量扩增目的基因,DNA分子热变性（在9095,O,C时，解,旋，双链分开温度降低又结合成双链）因此，在PCR技术中,不需要解旋酶,（与复制不同之在处),仪器：,PCR扩增仪（自动调控温度的仪器）,条件：,有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，脱氧核苷酸，酶等。,过程：,a,.,DNA,热变性（,90,95,O,C,)：,b,.,复性或退火,（5560,O,C)：,c,.,延伸,（7075,O,C,)：,d,.,重复,步骤：,双链,DNA,模板在热的作用下，氢键断裂形成单键,DNA,系统温度降低，引物结合到互补,DNA,链上，形成局部的双链,DNA,在,Taq,酶作用下，合成与模板互补 的,DNA,子链，形成双链,DNA,每重复一次，目的基因增加一倍,PCR,扩增为指数形式扩增,2,n,(,n,为扩增循环的次数），在短时间内扩增大量目的基因。,(3)用化学方法直接,人工合成目的基因,蛋白质氨基酸序列,mRNA的核苷酸,序列目,的基因序列,目的基因,针对：基因比较小，核苷酸序列又已知,推测,化学合成,推测,1,.,目的,：,二,.,基因表达载体的构建核心,IMN,2,.,组成,：,使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,。,同时使目的基因能表达和发挥作用。,(3),终止子,(4),标记基因,(2),启动子,(1)目的基因,不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建有所差异。,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,基因表达载体的构建,33,三、将目的基因导入受体细胞,1.,转化：,目的基因进入受体细胞内，并且在受体 细胞内维持稳定和表达的工程,2.常见转化方法：,农杆菌转化法：双子叶植物和裸子植物。,（1）,将目的基因导入植物细胞,基因枪法：单子叶植物。,花粉管通道法,（3）,将目的基因导入微生物细胞 感受态细胞法。,（,2,）将目的基因导入动物细胞,显微注射法。,特点:,农杆菌转化法：,（1）将目的基因导入,植物细胞,能感染,双子叶植物,和,祼子植物,对,大多数,单子叶植物,没有,感染能力,过程,：,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,适用生物：,双子叶植物,、,祼子植物,。,基因枪法：,利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体,DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法,操作方法：,金属粒：,将目的基因导入单子叶植物细胞,钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um。,适用：单子叶植物,旧式的基因枪靠火药为动力，将子弹头上粘的打出。其原理和声音都与鸟枪相仿，成功率仅为千分之八。小图为子弹,新式的基因枪靠高压氦气为动力，将微粒载片上的送出，成功率在左右。小图为微粒载片和阻挡网。,手提式基因抢,花粉管通道法：,将目的基因导入植物细胞,操作方法：,特点：,在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,十分简便经济,例：,转基因抗虫棉,细胞类型：,操作程序,：,_,显微注射法：,（2）,将目的基因导入,动物细胞,发育成新性状动物,移植到子宫或输卵管,培养成早期胚胎,显微注射,取受精卵,（体内或体外,受精）,提纯含目的基因表达载体,受精卵,倒置显微注射仪,德国莱卡公司,将目的基因导入动物细胞：,常用法：,常用菌：,微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,大肠杆菌,Ca,2+,处理,获得感受态细胞,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感 受 态,细 胞,表达载体,与感受态,细胞混合,感受态细胞,吸收,DNA,_,感受态细胞法,（3）将目的基因导入,微生物细胞,四,目的基因的检测与鉴定,（,1,）,DNA,分子与,DNA,分子的之间杂交,（,2,）,DNA,分子与,RNA,分子的之间杂交,（,3,）蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交,2.,个体生物学水平的鉴定：,抗虫、抗病结种实验，活性比较实验,1.,检测方法：,分子杂交技术：,1,.,检测,转基因生,物的DNA,探针,15,N,15,N,1,4,N,1,4,N,（,1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了,目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的DNA分子,方法：,DNA分子杂交技术,变性,变性,变性,方法：,DNA分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15,N,15,N,转基因生物,的mRNA,1,4,N,1,4,N,如果显示出杂交带，就表明待测样品目的基因已经转录。,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法,：,抗原,-,抗体杂交,苏云金杆菌,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,证明：,提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样,例：用棉铃饲喂棉铃虫，